簡介:,干細胞產品技術服務,,,,ORICELLTM,ORICELLTM,,,,最新產品,1ES成神經元分化試劑盒;2ES成心肌分化試劑盒;,3ES成肝實質細胞分化試劑盒;4MSC成肝實質細胞分化試劑盒;5NSC成神經元分化試劑盒;,6NSC成星型膠質細胞分化試劑盒;,目錄,胚胎干細胞培養(yǎng)和技術介紹,成體干細胞的常見問題與解決方案,1細胞和培養(yǎng)(干細胞、原代細胞產品和試劑)2細胞分化(多個方向的標準方法)3細胞示蹤(GFP/RFP和定制方法),干細胞凍存和復蘇方案干細胞應用技術,,,,STEMCELL,間充質干細胞(MSC),MESENCHYMALSTEMCELLS是一種多能干細,胞;,胚胎干細胞(ES),EMBRYONICSTEMCELLS是一種全能的干細,胞,神經干細胞(NSC),NEURALSTEMCELL是一種神經系統(tǒng)的多能干,細胞,,,,PRIMARYCELL,神經元系統(tǒng)(多個來源和物種,海馬、皮層)星型膠質細胞(多個物種皮層)肝實質細胞;,肝臟前體細胞;,分離其他客戶定制細胞;,,,,胚胎干細胞,,,,胚胎干細胞,胚胎干細胞EMBRYONICSTEMCELLES,細胞是指胚泡期的內細胞團中分離出的尚未分化的、能在體外培養(yǎng)、具有發(fā)育全能性的早期胚胎細胞無限增殖、自我更新,可分化為三個胚層來源的各種組織及細胞類型,ES細胞的來源5D胚胎,ABCD,,,,,ES生長特性,鼠生長快,胰酶消化,2天傳一次,可一傳多。,復蘇率較高。,人生長慢,機械分離,710天傳一次,相,對較少。1416。,復蘇率低。,,,,,,,表面抗原的表達,OCT4一種轉錄因子,發(fā)育全能性的標志。,堿性磷酸酶(AKP)常被用來作為鑒定ES,細胞及其分化與否的重要標志。,SSEA1小鼠ES表達,SSEA3、SSEA4人ES表達,,,,染色體結構,核型分析正常穩(wěn)定的二倍體核型。不隨傳代次數而改變。,46,XX;46,XY,,,核型檢測46,XX,多能性和全能性體內畸胎瘤實驗特定抗,擬胚體,特定條件誘體免疫導/自然分化組化,體外分化,去除飼養(yǎng)層細胞,,,,,全能性,體內畸胎瘤實驗,體外去除飼養(yǎng)層細胞,擬胚體(EB,EMBRYOIDBODY。為ES細胞懸浮,生長自發(fā)分化形成,含有內中外三個胚層組織,能基本上模擬體內的發(fā)育過程;貼壁誘導;,特定條件誘導/自然分化(除去LIF)各胚層特定抗體免疫組化檢測,體內畸胎瘤檢測,血管組織呼吸道上皮,鱗狀上皮,腺體組織脂肪組織,,,,體內分化,外胚層鱗狀上皮、神經組織等,中胚層骨和軟骨、橫紋肌、骨骼肌、血細胞和骨髓細胞等內胚層柱狀上皮、腸管樣組織等,,,,體外分化形態(tài),ES貼壁誘導,EB約57天后出現自主性搏動,,129MOUSE,HUMANES,,,,免疫組化檢測,NESTINECTODERMTROPONINMESODERM,TUBULINECTODERMAFPENDODERM,,,,神經分化貼壁誘導第2天,神經分化貼壁誘導第5天,,,,IHCΒ‐3TUBLIN,特異性抗原的表達情況,抗原人ES鼠ES,OCT4,NANOG,SSEA1ˉ,SSEA3ˉ,SSEA4ˉ,不斷有新的蛋白標記被發(fā)現和論證,,,,堿性磷酸酶染色,,,,小鼠ES流式圖,,,,染色體結構,核型分析正常穩(wěn)定的二倍體核型。不隨傳代次數而改變。,人(46,XX),鼠(40,XY,,,,性別分析,性別通過PCR的方法鑒定,目的基因是基因組,DNA的Y染色體相關基因TSPY,陽性對照用X,染色體相關基因POLA1以及GAPDH。,,ESCLONE,MESGFP,HUMANESGFP,,,,MEF細胞ES成功的一個重要因素,CYAGEN提供的MEF經過ΓIRRADIATION處理,,確保所有的細胞都完全失去增殖能力,又可以保證最佳支持和分泌能力,同時沒有任何化學有毒物質的污染,為你ES細胞提供最佳的生長環(huán)境;為ES的增殖提供多種因子;,,,,實驗室的調查普遍結果,據CYAGEN對多個實驗室使用的53個ES細胞,的樣品進行檢測,45被支原體污染;,沒有嚴格質量控制和環(huán)境控制的情況下制作的,MEF有35以上是攜帶支原體,這個數據,還根據操作技術不成熟,使用動物污染嚴重情況,風險也會大大的增加;,,,,絲裂霉素‐C(MITOMYCINC),A、長期接觸絲裂霉素‐C,藥物毒性將嚴重影響操作人員的身體健康;(單位量10‐30UG/ML處理20個10CMDISH需要3‐6MG),B、絲裂霉素‐C溶液的不穩(wěn)定,4℃保存,也會快速降解,導致處理的細胞不能完全失活,這將嚴重影響后面實驗分析;,C、絲裂霉素‐C的殘留,微量的絲裂霉素‐C也會造成ES細胞增殖抑制和分化;(因為其是細胞內DNA結合劑),,,,,OCT4SSEA1SSEA4,AAA,BBB,CCC,,,,ES細胞培養(yǎng)的過程,如何準備狀態(tài)良好的MEF細胞;消化傳代過程;,如何去除MEF細胞;挑克隆的操作;,如何準備用于進行各種基因操作的細胞;如何準備用于進行注射的細胞;,,,,如何準備狀態(tài)良好的MEF細胞;,取胚胎(135D)去除頭部和四肢;,剪碎后加入0125胰酶進行消化到組織塊基本消失;,終止消化并離心收集細胞;(檢測細胞支原體)重懸接種500010000CELLS/CM2第二天換液后培養(yǎng)3天,進行Γ射線照射;凍存檢測;,,,,生產過程控制,動物胚胎的孕齡;動物的污染物;細胞的支原體;,細胞的支持能力;細胞的失活;,蛋白表達檢測;,,,,合適的MEF的密度,細胞的貼壁效率;細胞的分泌能力;細胞的大??;,,,,最佳的密度受到很多因素影響25000CELLS,過密克隆生長緩慢,克隆小,但是立體感好;過稀克隆容易分化,邊緣不清晰,但是克隆增殖稍快;,最佳的密度克隆邊緣清晰,細胞容易增殖,大小均一。,,,,如何去除MEF,無飼養(yǎng)層培養(yǎng)但是代數非常有限,基本不能長期傳代;,MEF培養(yǎng)可以長期培養(yǎng),細胞的狀態(tài)好,不,影響細胞的全能性;,原理利用不同細胞的貼壁的時間差異;,步驟消化后離心重懸,在包被明膠的皿上貼壁,30MIN,輕輕吸出上清,接入另外一個包被有,明膠的皿中30MIN,再吸出上清中的細胞;并在包被的皿上培養(yǎng)一段時間,就可以去除大部分的MEF細胞;,,,,影響因素,克隆的狀態(tài)分化的細胞的貼壁性會大大增加;,MEF的狀態(tài)MEF如果有大量的碎片也會增加,液體的粘稠度干擾細胞的正常分離;,消化的效果如果有MEF沒有和ES很好的分開,會將ES一起貼在皿上;,細胞團和顆粒顆粒大細胞團會導致細胞快速沉淀并導致細胞貼壁;,如果效果不佳可以進行多次的重復,但是會大大減少細胞的回收率;,,,,ES細胞的傳代,細胞的克隆出現足夠大,細胞的邊緣開始出現不清晰,細胞的克隆出現部分分化的情況;一般的周期是35天;,傳代比例依據細胞的克隆大小和細胞的生長狀態(tài),比例為15110;,消化的時候觀察一般以MEF為標準,如果MEF基本上已經開始脫壁就可以終止消化;,,,,,,,,,挑克隆技術,當克隆大部分出現分化的時候;克隆大小不均并且生長緩慢;注意事項,拉針(要注意末端的大小)或使用1ML的注射器;,在體視鏡下操作,要在解剖超凈臺中操作;注意環(huán)境,避免污染;,提取的克隆要消化后才能進行接種;單克隆的培養(yǎng)周期長,要更有耐心;,,,,用于ES囊胚注射的細胞控制,低代數(細胞的全能型和基因變異和染色體變異),低分化程度(細胞分化會大大影響細胞最后的整合的效率和生殖遺傳的比例),最低的控制標準正常的核型,細胞的各種分化蛋白沒有表達,各種ES的正常表達蛋白正常;具有成瘤性;增殖速度快;無任何外源污染;,,,,其他類型的成體干細胞,間充質干細胞神經干細胞,,,,,,間質干細胞是目前研究最多的干細胞,來源研究方向不斷有文章報道從不同的組織分離出MSC,整體方向是有利臨床廣泛取材和減少病人痛苦;,與組織工程結合的研究方式,最重要是如何提高與組織的相容性和提高在向多個方向分化的控制,如何成為一個真正的組織;,臨床治療研究,也是目前細胞治療的研究熱點,國內主要的治療細胞;,基因研究的載體,干細胞分化機制模型;,,,,CYAGEN能夠提供協(xié)助,來源研究基本上從體內的各個組織中發(fā)現非常多的干細胞,包括肌肉,肺部,肌腱,血管,皮膚等,而這些細胞都具有含量非常少,同時也具有非常明顯的組織特意性,表達非常多的組織特異性的蛋白;(提供高難度提取服務),組織材料學結合納米材料和其他生物學材料,用于研究具有臨床前景的材料;(細胞相容性,蛋白表達,細胞分化分析等),臨床研究如何從單一來源獲得大量穩(wěn)定而且維持良好的生物學特性的細胞,同時保證生物的安全性;(提高全套的技術支持和服務),,,,間質干細胞,定義來源于中胚層的早期細胞,能夠分化為多種中胚層和神經外胚層來源的細胞。,來源組織骨髓、骨膜、脂肪組織、臍血等。來源物種人、大鼠、小鼠、猴子、犬、兔子、豬等。,,,,分離方法,骨髓,人,猴子,犬,密度梯度離心法不同顆粒之間存在沉降系數差時,在一定離心力作用下,顆粒各自以一定速度沉降,在密度梯度不同區(qū)域上形成區(qū)帶的方法。,大鼠,小鼠,兔子全骨髓貼壁法,脂肪等組織,人、大鼠、小鼠酶消化法,,,,,,,鑒定方法不同物種的表面標記差異,表面標志人,猴子大鼠小鼠,陽性CD29,CD44,CD71,CD90CD29,CD44,CD105CD29,CD44,CD166,陰性CD34,CD45,CD105,CD166CD34,CD45弱陽CD34,CD45,,,,傳代能力,有限增殖,隨著傳代次數增加,分化能力逐漸降低,按照12的比例,人12代達到純化,最多1520代。,大鼠34代達到純化,最多2025代。,小鼠78代達到純化,最多2530代。,,,,間充質干細胞培養(yǎng)的問題/解決方案,BMSCS來源長骨的骨髓,體內與造血功能有緊密關系,,但是也存在牙髓和其他短骨里面,缺點是取材時給病人的痛苦較多;,ADSCS來源全身的脂肪組織,包括皮下和內臟脂肪墊;,來源屬于微創(chuàng)方法取材,主要是來源于抽脂減肥的手術;,其他來源的間質干細胞胰腺干細胞、心臟干細胞、肝臟干細胞、肌腱干細胞和牙周膜干細胞等;還有新生兒的臍帶、胎盤等其他組織;,,,,細胞形態(tài)不同的組織來源的間質干細胞的形態(tài)多樣,,基本無法從細胞的形態(tài)上進行有效的區(qū)分;,表面抗原不同來源的細胞的表面標記會有差異BMSC和ADSCS的區(qū)別就是CD106(/)和CD49D(,/);,分化能力會有較大的波動,隨著不同個體、不同組織,來源會有變化;,培養(yǎng)液選擇不同來源也是不同,,,,,間質干細胞形態(tài)特征,P0,40X,P3,40X,,,,骨髓間質干細胞定向分化為脂肪細胞,,,,,梭形、纖維樣細胞原代克隆樣生長傳代后勻質、渦旋狀排列,HUMANDOG,RATMONKEY,MOUSERABBIT,,,,間質干細胞培養(yǎng)系統(tǒng),標準,1增殖速度變化;2細胞分化影響;3形態(tài)學變化;,4克隆形成率變化;5基因表達影響;,6使用的特殊要求;7價格因素;,,,,如何選擇間質干細胞培養(yǎng)系統(tǒng),基礎培養(yǎng)基的選擇依據細胞的生長和要求參照文,章進行優(yōu)化,需要添加部分的氨基酸或者糖;,血清篩選應該利用10株以上的細胞,進行克隆,形成率、生長曲線、分化能力的比較;,添加物營養(yǎng)物質、抗氧化物質、抗生素、細胞,因子添加;,優(yōu)選專業(yè)血清,普通胎牛血清,普通牛血,清,,,,,,細胞培養(yǎng)過程常見問題,細胞增殖速度下降間質干細胞不是無限的細胞系,最佳的實驗窗口是P3P8;,細胞老化培養(yǎng)環(huán)境不適合(包括培養(yǎng)的表面和培養(yǎng)液);胰酶對細胞表面蛋白的傷害;缺乏相關的生長因子;細胞本身端粒影響;,細胞分化血清中激素影響、培養(yǎng)表面影響、體外培養(yǎng)時間影響;,,,,間質干細胞常見的污染和控制,細胞污染、造血系統(tǒng)細胞;,取材來源污染病毒、或者其他感染;,支原體污染隱性污染,一般難以察覺,導致細胞狀態(tài)不斷下降,影響細胞正常增殖,擴散和污染環(huán)境,影響最大;,,,,神經干細胞,廣泛存在于成年或胚胎哺乳動物大腦內,可分化為神經元、星形膠質細胞、少突膠質細胞。,,,,神經干細胞,,,,神經干細胞生物學特性,NESTIN陽性,自動聚集成球,球體的表面存在絨毛懸浮生長,無血清培養(yǎng),血清替代物,BFGF,EGF,,,,神經干細胞,,,,NSC存在神經系統(tǒng)中的干細胞,分化神經元、星型膠質細胞、少突膠質細胞等,,,,NSC取材和培養(yǎng),鼠神經干細胞(NSC)來源于145D胚胎的大腦GE區(qū);,,,大鼠神經干細胞懸浮培養(yǎng)小鼠神經干細胞貼壁培養(yǎng),大鼠神經干細胞貼壁培養(yǎng)小鼠神經干細胞貼壁培養(yǎng),,,,使用CYAGEN神經干分化試劑,使用血清誘導,,,,NSC的操作要點,傳代培養(yǎng),1、懸浮培養(yǎng)必須控制球的大小,傳代時,自然沉降,去除其中大球;可以使用機械的方法;,2、懸浮法培養(yǎng)可以獲得大量的細胞;,3、貼壁法培養(yǎng)細胞可以用于轉基因操作,,但是費用很高;,4、整個培養(yǎng)過程必須保證無血清;5、保證細胞純度,獲得高擴增率;,,,,干細胞的分化機理和相關的技術產品,,,,干細胞分化機理,WILDTYPE,MOUSE,FIBROBLASTS,MOUSE,FIBROBLASTS,CARRYING,MYF5BAC,,,,干細胞分化能力鑒定,分化試劑(檢測干細胞的尺)必須穩(wěn)定,否則結,果波動非常大,將無法分析;,每次配置的分化試劑必須是有陽性對照進行檢測,保證有分化誘導能力再用于檢測其他的細胞;不同的物種間最佳的誘導物濃度不同,所以不同物種間最好做一下濃度上面的優(yōu)化;,,,,,,,,,,干細胞分化的常見問題,分化比例影響因素;,細胞群分化能力整個細胞群體中干細胞的比率決定;代數細胞的分化比率隨代數增加下降;,誘導系統(tǒng)穩(wěn)定性誘導組方、藥物效價和配置過程影響;,,,,,,,分化時間影響因素,成骨24周成脂24周,成軟骨34周,不同物種人和大鼠容易誘導,小鼠的需要更長時間,狗和兔子誘導時間波動大;,動物大小影響人和靈長類、狗等胚胎期或者新生代幼體分化率偏低;而成體的來源的MSC分化能力高,臍帶、臍血的MSC分化比例較低。,細胞質量影響才是影響分化關鍵的核心,,,,分化的影響因素,不同的物種波動很大,不能橫向比較;,不同提取方法操作方法的差異,導致細胞群組成差異;,不同的培養(yǎng)系統(tǒng)影響細胞的形態(tài)、大小、克隆的形態(tài)也不同,分化能力也有差異;使用A,MEM會降低干細胞的成脂肪分化;,不同代數分化也是會有波動,同時各個方向的分化變化的速度不同步;,,,,CYAGEN提供完善的分化系統(tǒng),骨、脂肪、軟骨分化囊括了多個物種、多種來源的干細胞的分化的試劑;穩(wěn)定高效干細胞的金指標;心肌分化、神經分化,ORICELLTM提供定制的分化服務;,,,,干細胞大規(guī)模培養(yǎng)解決方案,應用的方向;,大動物的體內實驗包括靈長類等,需要的細胞量都是,108這個數量級以上;,多組動物的實驗要獲得更加有說服力結果;大規(guī)模的篩選中藥成分篩選、藥物單體實驗;臨床使用干細胞干細胞的最終應用;,ORICELLTM提供大規(guī)模細胞培養(yǎng)服務,,,,ORICELLTM大規(guī)模培養(yǎng)的實現,使用T175培養(yǎng)數量上可以直接增加,但是增加污染的風險,系統(tǒng)不穩(wěn)定;,使用多層培養(yǎng)瓶、轉瓶;,使用小型細胞培養(yǎng)罐細胞擴增容易但是收獲困難,條件控制不成,熟;,密閉的細胞工廠系統(tǒng)全密閉系統(tǒng),可以用增加數量方法放大規(guī)模,但是成本較高,需要環(huán)境控制系統(tǒng);,,,,,,,,,干細胞質量控制和解決方案;,表面標記與細胞分化,表面標記有哪些核心標記現在目前并未有一個非常特異得到公認的表面抗原分子;,CYAGEN研究發(fā)現,表面抗原分子和分化不具有,穩(wěn)定相關性;,表面抗原變化主要集中在前期和高代數時變化;分化能力的變化主要和代數有關,和表面標記有半相關性;,,,干細胞增殖能力指標;,生長曲線表現細胞自我更新能力的一個指標;克隆形成率表示具有較強自我更新能力的細胞,的比例的指標;,屬于和干細胞“SELFRENEW”相關;,,,,,,,,,體內實驗使用細胞污染物控制,細胞污染物的控制和檢測方法;,細胞間污染不能不同細胞一起操作,使用相同的一瓶試劑;操作最好間隔1個小時;,細菌污染所有使用的培養(yǎng)試劑進行無菌檢測;,真菌污染嚴重影響細胞體內試驗,一旦出現極難處理;內毒素對所有使用的器械、容器、管道都進行處理,,250度干烤或者是用堿洗;,外源異物污染避免使用玻璃操作,使用有認證的產品,個人防護;同時使用前對細胞懸液中進行觀察,看是否有顆粒;,,,,大規(guī)模和有穩(wěn)定質量控制的細胞的應用,動物的體內試驗和解決方案,,,,干細胞的動物體內實驗,,,,,,,,干細胞體內應用的注意事項,凍存的細胞是否可以復蘇直接用于實驗;理論上是可行,但是對凍存液要求很高;復蘇率達到90以上,減低死亡細胞影響;,MSC類的細胞普通凍存液復蘇后細胞非常的脆,弱,最好經過一次的培養(yǎng);,需要清洗去血清和DMSO(2511G/KG),同時降低內毒素;,ORICELLTMNCR凍存液、DMSOFREE凍存液,,,,細胞自然成團對體內實驗的影響,導致血管內出現細胞栓塞,直接導致動物急性死亡;,會在肺部、肝積聚,減低器臟功能,長期會有纖維化風險;,細胞在懸浮的狀態(tài)下,會自然的聚集成松散團;死細胞多,釋放的DNA會導致細胞聚成大團;,1一小時內使用,2細胞充分吹勻或者使用濾網200250目3培養(yǎng)過程中細胞絕對不能過密80最佳4細胞代數不能太高90,不影響干細胞的特性;細胞增殖不改變、細胞,分化不改變;,容易使用、穩(wěn)定性高,可以直接使用,無需任何的操作,凍存過程中細胞環(huán)境穩(wěn)定,無溫度波動,干細胞的凍存,凍存流程,1、選擇處于對數生長期的細胞,按照常用的方法收集細胞于試管中,計算細胞數量。,2、離心收集的細胞(參考離心條件4℃,250G,35分鐘),吸去上清液。,3、加入適當的凍存液到離心管,緩慢混合均勻,制成細,胞混合液。細胞凍存濃度約為105~106CELLS/ML。,4、將離心管中的細胞混合液分裝至已做標識的凍存管。5、將分裝好細胞的凍存管直接放于80℃冰箱,24H后可以移入196℃液氮中長期保存。,,,,干細胞的復蘇,復蘇流程,1、準備好相應的細胞培養(yǎng)液,平衡至室溫;往離心管中加入68ML細胞培養(yǎng)液。準備37℃水浴。,2、從80℃冰箱或液氮取出凍存的細胞,迅速放入37℃水浴中快速晃動,待凍存懸液完全溶解后,往凍存管中加入1ML細胞培養(yǎng)液,稍微吹打后立即將細胞混合液移入裝有細胞培養(yǎng)液的離心管中,混合均勻。,3、離心收集的細胞(離心條件可參考細胞凍存方法),盡量移去上清液。,4、加入細胞培養(yǎng)液重懸細胞,制成細胞懸液,按各自實驗所需密度接種至細胞培養(yǎng)器具中。,,,,我們的合作伙伴,非常感謝大家對我們的關注,
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上傳時間:2024-01-06
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