簡介：目的嚴重發(fā)熱伴血小板減少綜合征病毒SEVEREFEVERWITHTHROMBOCYTOPENIASYNDROMEVIRUS，SFTSV，又名蜱蟲病病毒，是近年在我國河南，安徽和湖北等中東部省份傳播的新發(fā)血液傳播病毒，由病毒感染引起的嚴重發(fā)熱伴血小板減少綜合征具有1030％的致死率。目前，我國尚無SFTSV在獻血人群中的流行情況報道。本研究擬調(diào)查我國三個地區(qū)獻血人群嚴重發(fā)熱伴血小板減少綜合征病毒的抗體和病毒血癥流行情況。方法本研究于2012年4月至10月，收集來自我國SFTSV主要流行疫區(qū)河南信陽，非疫區(qū)洛陽和四川綿陽等三地共計17208份健康獻血員血漿樣本。采用酶聯(lián)免疫熒光法ENZYMELINKEDIMMUNOASSAY，ELISA對樣本進行抗SFTSV總抗體檢測。同時，采用高靈敏度逆轉(zhuǎn)錄熒光定量PCRREVERSETRANASEPCR，RTPCR，對信陽地區(qū)2490份匯集樣本（4人份一匯集，共9960人份）進行SFTSV核酸匯集篩查，對核酸陽性匯集進行拆分核酸單檢，并對ELISA陽性樣本也進行核酸單檢確認。結(jié)果我國三地獻血人群抗SFTSV總抗體流行情況依次為信陽地區(qū)（主要流行疫區(qū)），054％8014752綿陽地區(qū)，027％31130和洛陽地區(qū)，023％31326。信陽地區(qū)的抗SFTSV總抗體流行率略高于洛陽和綿陽地區(qū)，但無顯著性差異。信陽地區(qū)80例抗體陽性獻血員的年齡、性別和職業(yè)分布等人口統(tǒng)計學特征無顯著性差異。信陽地區(qū)SFTSVRTPCR檢測結(jié)果表明，63個匯集為陽性擴增632490。進一步拆分單檢后，檢出兩例SFTSV核酸陽性樣本，且病毒載量均低于20PFUML，表明信陽地區(qū)SFTSV核酸流行率為002％29960。結(jié)論SFTSV在我國信陽、洛陽和綿陽三地區(qū)健康獻血人群中存在較低流行率，且病毒載量極低。SFTSV是否威脅我國血液安全還需進一步的調(diào)查研究。

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簡介：目的了解某地區(qū)獻血員及HBSAG陰性的白血病患者中隱匿性HBV感染的檢出率并探討其與研究對象年齡、性別、生化學檢測結(jié)果以及乙型肝炎病毒標志物之間的關(guān)系同時從S基因變異角度探討隱匿性HBV感染可能的分子機制。方法①病例選擇和標本收集收集2010年6月2010年9月間經(jīng)某地區(qū)血站篩查HBSAG陰性的合格獻血員血漿594份。另收集2010年9月2010年10月間某地區(qū)三甲醫(yī)院檢驗科檢驗結(jié)果為HBSAG、抗HBC定量檢測雙陽性且HBVDNA陽性的HBV感染者做對照。87份HBSAG陰性的白血病患者血清標本均來自2010年8月至2010年12月間在某地區(qū)三甲醫(yī)院血液科確診為白血病的患者包括急性及慢性白血病患者。②HBVDNA提取采用經(jīng)典蛋白酶K消化酚氯仿法。③巢式PCR法檢測HBVDNA參考國內(nèi)外文獻及HBV參照序列在HBV基因組S、C、X區(qū)分別設(shè)計一對巢式引物。巢式PCR擴增當任兩個區(qū)同時陽性者定義為隱匿性HBV感染者。④雅培ARCHITECTI2000R電化學發(fā)光儀定量檢測隱匿性HBV感染者的HBV血清學標志物對隱匿性HBV感染者與非感染者進行性別、年齡、生化學檢測結(jié)果以及HBV血清標志物等的比較。⑤擴增HBVDNA陽性者小S區(qū)測序根據(jù)HBV參照序列在S區(qū)設(shè)計引物對隱匿性HBV感染者以及11例HBSAG和抗HBC雙陽性的HBV感染者進行擴增測序并進行基因型、HBSAG“Α”決定簇突變分析發(fā)現(xiàn)可能和隱匿性HBV感染有關(guān)的變異位點。結(jié)果一、獻血員①在594例獻血員中有15例為隱匿性HBV感染隱匿性HBV感染的發(fā)生率為25％15594。未發(fā)現(xiàn)HBV血清學標志物檢測結(jié)果與隱匿性HBV感染有相關(guān)性。②將獻血員中隱匿性HBV感染者和陽性對照ⅠS區(qū)的測序序列與HBV標準序列相比較結(jié)果共檢測到2種基因型HBVBHBVC其中HBVB基因型占優(yōu)勢10例隱匿性HBV感染者HBV基因型分別為HBVB9例HBVC1例而11例陽性對照ⅠHBV基因型分別為HBVB10例HBVC1例。隱匿性HBV感染者和陽性對照Ⅰ相比較兩者的基因型分布并無統(tǒng)計學意義。③獻血員中15例隱匿性HBV感染者中共10人有S區(qū)測序結(jié)果其HBVDNA均有不同程度的變異其中共有3例在“A”決定簇內(nèi)出現(xiàn)氨基酸突變分別為I126T1例、T140I2例。與隱匿性HBV感染者相比陽性對照Ⅰ在“A”決定簇內(nèi)僅出現(xiàn)了1例T131N變異。二、白血病①在87例HBSAG陰性的白血病中隱匿性感染者有15例隱匿性HBV感染的檢出率為1721587。實驗組的年齡、性別分布、生化學檢測結(jié)果等與對照組相比差別無統(tǒng)計學意義。②在白血病患者中隱匿性HBV感染的抗HBC陽性的檢出率46Q5顯著高于對照組中抗HBC陽性檢出率97W2Χ212548P﹤0001即在白血病患者中抗HBC陽性與否與隱匿性感染有顯著相關(guān)性。③白血病患者中隱匿性HBV感染者共檢測到2種基因型HBVBHBVC其中HBVC基因型占優(yōu)勢11例隱匿性HBV感染者HBV基因型分別為HBVC10例HBVB1例與獻血員中隱匿性HBV感染者的測序結(jié)果差別較大。④白血病中15例隱匿性HBV感染者中共11人有S區(qū)測序結(jié)果其中1例隱匿性HBV感染者出現(xiàn)了插入突變另2例提前形成終止密碼形成縮短的氨基酸序列并有6例有氨基酸突變存在。在不同基因型的隱匿性HBV感染者中在MHR區(qū)存在變異的5例基因型C病毒株均發(fā)生了I126T變異而唯一1例基因型B病毒株發(fā)生的是Q129R、D144E、S155Y聯(lián)合變異。結(jié)論①在本地區(qū)獻血員及HBSAG陰性的白血病患者中隱匿性HBV感染的檢出率分別為25和172。②在白血病患者中抗HBC陽性與隱匿性HBV感染有明顯的相關(guān)性。③白血病患者中隱匿性HBV感染者與本地區(qū)慢性HBV感染者基因型有顯著不同。④HBVS區(qū)基因變異尤其是HBSAG“Α”決定簇存在氨基酸改變可能是隱匿性HBV感染的分子基礎(chǔ)但其意義尚有待明確。

簡介：目的應(yīng)用實時熒光定量PCR及RTPCR法對武漢地區(qū)類流感樣監(jiān)測病例的咽拭子標本進行人鼻病毒HUMANRHINOVIRUSHRV和人腸道病毒HUMANENTEROVIRUSHEV的檢測和分型了解人鼻病毒人腸道病毒HRVHEV在武漢地區(qū)的感染現(xiàn)狀、亞型構(gòu)成、分子進化以及年齡、季節(jié)分布等流行情況揭示和闡明人鼻病毒、人腸道病毒的流行特點及規(guī)律為人鼻病毒、人腸道病毒等相關(guān)呼吸道感染的防控、臨床診斷與治療、疫苗的研發(fā)提供理論依據(jù)。研究對象及方法1收集武漢地區(qū)2007年7月至2011年12月期間武漢市一醫(yī)院和武漢市兒童醫(yī)院門診流感樣病例體溫≥38℃同時伴有咳速或咽痛之一者的咽拭子標本共計4065份。2收集咽拭子標本后低溫運送至武漢市疾病預防控制中心病毒科。咽拭子標本經(jīng)核酸提取后采用HRV、HEV通用引物及探針和實時熒光定量PCR法檢測HRVHEV同時每份標本采用PCR及RTPCR法檢測A型和B型副流感病毒IFVA和B型、人偏肺病毒HMPV、呼吸道合胞病毒RSV、偏肺病毒PIV1、2、3、冠狀病毒HCOVHKU1和NL63型、腺病毒ADV及人博卡病毒HBOV。隨機選取50例HRVHEV檢測陽性樣本應(yīng)用HRV、HEV分型引物對VP4VP2區(qū)段進行RTPCR擴增并對擴增產(chǎn)物進行測序所得測序結(jié)果與美國國立生物技術(shù)中心NCBIGENEBANK中的序列進行BLAST比較分析。利用MEGA51軟件中的鄰接法進行系統(tǒng)進化分析。結(jié)果在4065份流感樣病例的咽拭子標本中共檢出HRVHEV陽性標本170例總檢出率為418％其中23例陽性標本存在與其它呼吸道病毒的混合感染23170135。在混合感染病例中333824的病例混合感染腺病毒ADV208524的病例混合感染冠狀病毒HCOV167424的病例混合感染副流感病毒PIV83224的病例混合感染人偏肺病毒HMPV83224的病例混合感染博卡病毒HBOV42124的病例混合感染甲型H1N1流感病毒42124的病例混合感染乙型流感病毒。各年齡組HRVHEV感染者中03歲、414歲、1525歲、2665歲及65歲年齡組的檢出率分別為701171662、4543948、055930、115477和000483歲以下包括3歲兒童陽性率明顯高于3歲以上年齡組Χ257300P0000。2008年7月2011年12月檢測結(jié)果顯示HRVHEV在武漢地區(qū)流行呈現(xiàn)明顯的季節(jié)性以春夏兩季為高發(fā)季節(jié)。50例HRVHEV通用引物檢測陽性的標本中34例分型成功。其中9例為HRV單獨感染23例為HEV單獨感染2例為HRV和HEV混合感染。11例HRV感染者中6例為HRVA5452例為HRVB1823例為HRVC27325例HEV感染者中10例為HEVA4015例為HEVB60。系統(tǒng)進化分析發(fā)現(xiàn)武漢地區(qū)流行的HRV、HEV與其對應(yīng)的參考株在進化上十分接近但武漢流行株也表現(xiàn)出了基因變異和遺傳分化的跡象。結(jié)論HRVHEV的檢出率較高是引起武漢地區(qū)人群急性呼吸道感染的一個重要病因。不同年齡組HRVHEV感染率不同其中3歲及3歲以下兒童為易感人群。武漢地區(qū)HRVHEV的流行呈現(xiàn)明顯的季節(jié)性以春夏兩季為高發(fā)季節(jié)。武漢地區(qū)HRV感染與HEV感染均呈現(xiàn)基因多樣性其中HRVA、HEVB分別為HRV感染和HEV感染最主要的基因型。

簡介：目的構(gòu)建人血管內(nèi)皮生長因子HUMANVULARENDOTHELIALGROWTHFACT，HVEGF165腺相關(guān)病毒ADENOASSOCIATEDVIRUS，AAV載體AAVHVEGF165，并體外檢測其在椎間盤纖維環(huán)細胞中的表達，以及觀察AAVHVEGF165與AAVTGFΒ1TRANSFMINGGROWTHFACTBETA1，TGFΒ1基因聯(lián)合轉(zhuǎn)染對纖維環(huán)細胞Ⅰ型膠原的生物學效應(yīng)。探討應(yīng)用HVEGF165基因逆轉(zhuǎn)椎間盤退變可行性。方法采用分子克隆技術(shù)，從PCDNA3HVEGF165質(zhì)粒獲得HVEGF165CDNA，并克隆至AAV包裝質(zhì)粒PSNAV上，構(gòu)建成PSNAVHVEGF165的AAV重組質(zhì)粒，經(jīng)酶切及測序鑒定正確，用脂質(zhì)體介導PSNAVHVEGF165轉(zhuǎn)染HEK293細胞和血管內(nèi)皮細胞VEC，熒光免疫組化方法檢測HVEGF165蛋白，并用MTT法測定HVEGF165對VEC增殖的影響。由本元正陽公司對鑒定正確的PSNAVHVEGF165進行AAVHVEGF165的包裝。AAVHVEGF165與AAVTGFΒ1聯(lián)合轉(zhuǎn)染原代培養(yǎng)的椎間盤纖維環(huán)細胞，WESTERNBLOTTING檢測HVEGF165與TGFΒ1的表達以及纖維環(huán)細胞Ⅰ型膠原表達量的變化。結(jié)論構(gòu)建的腺相關(guān)病毒載體AAVHVEGF165可在體外表達，HVEGF165在體外能夠協(xié)同TGFΒ1促進纖維環(huán)細胞Ⅰ型膠原表達的增加，HVEGF165有可能基因逆轉(zhuǎn)椎間盤的早期退變。

簡介：乙型肝炎是由乙型肝炎病毒HEPATITISBVIRUS，HBV感染引起的一種常見的、嚴重的肝臟疾病。盡管一些抗病毒藥物如拉米夫定LAMIVUDINE，3TC、阿德福韋酯ADEFOVIRADV等能夠有效的抑制乙肝病毒復制，慢性乙肝仍然是一種無法徹底治愈的疾病。目前，在抗乙肝病毒治療中核苷類藥物起著關(guān)鍵作用。但是，長期使用會產(chǎn)生耐藥和毒副作用，這可能導致治療失敗、肝臟疾病的發(fā)展。因此，尋找療效顯著、低毒副作用的新型抗HBV藥物仍然具有重要意義。鴨乙型肝炎DUCKHEPATITISBVIRUS，DHBV模型是目前國內(nèi)外公認的一種評價抗HBV藥物的體內(nèi)動物模型。本文首先建立了河南地區(qū)后天感染麻鴨乙肝病毒模型，然后采用HEPG2215細胞為體外模型，評價新型核苷類藥物ΑDDBDU的體外抗病毒活性采用建立的鴨乙肝模型為體內(nèi)模型，評價ΑDDBDU的體內(nèi)抗病毒活性及保肝作用。第一部分后天感染河南麻鴨乙肝病毒模型的建立。目的建立河南麻鴨乙型肝炎病毒標準模型，并初步觀察拉米夫定3TC體內(nèi)抗DHBV作用。方法篩選3日齡DHBV陰性河南麻鴨，經(jīng)脛靜脈注射DHBV陽性血清，連續(xù)觀察42天，采用熒光定量聚合酶鏈式反應(yīng)FLUSESCENCEQUANTITATIVEPOLYMERASECHAINREACTION，F(xiàn)QPCR檢測鴨血清和肝臟中DHBVDNA變化情況。隨后用3TC對建立的模型進行初步應(yīng)用。模型組給予生理鹽水2MLKGD，3TC組給予3TC20MGKGD，連續(xù)給藥10天。FQPCR檢測給藥后5天、10天及停藥后3天血清和肝臟中DHBVDNA抑制率，并進行肝臟病理學觀察。結(jié)果感染2D后，血清和肝臟中均可檢測到DHBVDNA。血清第14天達到高峰，肝臟第21天達到高峰，在42天內(nèi)均維持較高的DHBVDNA水平。3TC用藥10天后，血清和肝臟HBVDNA抑制率分別為8647％和8492％，肝組織炎性病變較模型組明顯減輕，但停藥3天有輕度“反跳”現(xiàn)象。結(jié)論河南麻鴨后天感染DHBV較敏感，病毒在體內(nèi)增殖穩(wěn)定，是DHBV感染的理想疾病模型，該模型可用于抗HBV藥物的篩選和評價。第二部分新型核苷聯(lián)苯雙酯化合物ΑDDBDU抗HBV作用研究。目的探討新型核苷類化合物ΑDDBDU體內(nèi)和體外抗乙肝病毒作用。方法ΑDDBDU體外抗病毒活性的研究選用能夠合成、分泌HBV顆粒和表達HBV抗原標志物的HEPG2215細胞株為模型，采用MTT法檢測不同濃度ΑDDBDU的細胞毒性酶聯(lián)免疫吸附法ENZYMELINKEDIMMUNOSBENTASSAY，ELISA檢測不同濃度ΑDDBDU對細胞上清中HBSAG和HBEAG的抑制作用FQPCR法檢測ΑDDBDU對細胞內(nèi)外HBVDNA水平的抑制作用。體內(nèi)抗病毒活性的研究采用已建立的后天感染河南麻鴨乙肝病毒模型。感染后，DHBV陽性鴨隨機分成5組，藥物組給予不同劑量的ΑDDBDU（08、4和20MGKGD），陽性對照組給與3TC20MGKGD，模型組與陰性對照組給予生理鹽水2MLKGD，連續(xù)給藥10天。在第5、10和停藥后第3天，收集血清和肝組織樣品，檢測血清和肝臟中DHBVDNA及ALTALANINEAMINOTRANSFERASE、ASTASPARTATEAMINTRANSFERASE的水平。用藥10天后，對肝臟進行組織病理學觀察。結(jié)果ΑDDBDU對HEPG2215的半數(shù)毒性濃度CC50為43616ΜM。不同濃度的該化合物（02ΜM、1ΜM、5ΜM）作用于細胞，能夠顯著的抑制S抗原和E抗原的分泌，抑制作用與時間和劑量呈正相關(guān)。ΑDDBDU濃度為5ΜM時，能夠有效地抑制HBVDNA的復制。藥物作用第九天，細胞內(nèi)和細胞外DHBVDNA抑制率分別為8118％和8855％。給予不同劑量ΑDDBDU08，4，20MGKGD治療感染DHBV的鴨子，能夠顯著抑制DHBVDNA的復制。給藥10天，鴨血清和肝臟中DHBVDNA的抑制率分別達到9375％和8943％。此外，血清和肝臟中ALT、AST水平顯著下降，鴨肝臟的組織病理學結(jié)果表明ΑDDBDU對肝組織有明顯改善作用。結(jié)論ΑDDBDU對HBV的復制具有較強的抑制活性，并且對肝組織病理學具有顯著地改善作用。

簡介：目的建立兔椎間盤退變模型檢測腺相關(guān)病毒ADENOASSOCIATEDVIRUS，AAV）介導的成骨蛋白1OP1和SOX9雙基因體內(nèi)轉(zhuǎn)染對兔退變椎間盤的生物學效應(yīng)。方法成年新西蘭大白兔通過針刺纖維環(huán)法建立椎間盤退變模型，造模后3周分別進行MRI檢測，觀察造模椎間盤變化，確認兔退變椎間盤模型造模成功。將造模成功的動物隨機分為五組N5，分別A組雙基因組（RAAV2HSOX9RAAV2HOP1）B組OP1組RAAV2HOP1C組SOX9組RAAV2HSOX9D組EGFP組RAAV2EGFPE組PBS對照組。分別于造模椎間盤髓核內(nèi)注射20ΜL雙基因組混合液（配制比例1∶1）、RAAVOP1、RAAVSOX9、RAAVEGFP、PBS磷酸鹽緩沖液，于手術(shù)后3、6、9周后行核磁共振掃描觀察退變椎間盤變化情況，同時取退變椎間盤組織，RTPCR方法觀察Ⅱ型膠原MRNA及蛋白多糖MRNA的變化。結(jié)果基因轉(zhuǎn)染后3周、6周、9周時，核磁共振掃描證實A、B、C組與D、E組，退變椎間盤T2加權(quán)像的信號強度明顯恢復，A組與B組、C組T2加權(quán)像的信號強度兩兩比較顯示具有顯著統(tǒng)計學意義P＜005基因轉(zhuǎn)染后3周、6周、9周時，RTPCR法證實A組、B組、C組在不同轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)了Ⅱ型膠原及蛋白多糖MRNA的表達，A組Ⅱ型膠原及蛋白多糖MRNA表達量均高于其他各組，比較差異有統(tǒng)計學意義P＜005B、C組間Ⅱ型膠原MRNA比較差異無統(tǒng)計學意義P＞005B、C組間蛋白多糖MRNA比較差異有統(tǒng)計學意義P＜005。結(jié)論RAAV介導的SOX9及OP1雙基因聯(lián)合轉(zhuǎn)染對退變椎間盤組織有明顯的治療作用并且可以持續(xù)高效表達9周，有效的促進退變椎間盤蛋白多糖和Ⅱ型膠原的合成雙基因治療椎間盤退變具有協(xié)同效用SOX9基因可以明顯提高Ⅱ型膠原MRNA的表達，不能上調(diào)蛋白多糖MRNA的表達。

簡介：目的本研究比較IL32在正常皮膚和病理性瘢痕組織中的表達及分布情況，探討IL32在病理性瘢痕的形成過程中所起的生物學作用及意義。同時，為進一步研究病理性瘢痕的防治，構(gòu)建能表達人IL32的真核表達載體及含有人IL32基因介導的重組腺相關(guān)病毒載體，為下一步轉(zhuǎn)染瘢痕疙瘩成纖維細胞，觀察IL32基因在細胞中表達后對細胞增長的影響奠定實驗基礎(chǔ)。方法1以正常皮膚作為對照，應(yīng)用RTPCR方法檢測IL32MRNA在正常皮膚、增生性瘢痕和瘢痕疙瘩組織中的表達水平。2以正常皮膚作為對照，應(yīng)用免疫組化檢測IL32蛋白在正常皮膚、增生性瘢痕和瘢痕疙瘩組織中的表達及分布情況。3以正常皮膚作為對照，應(yīng)用WESTERNBLOTTING檢測IL32蛋白在正常皮膚、增生性瘢痕和瘢痕疙瘩組織中的表達及分布情況。4設(shè)計引物，合成目的片段IL32566BP。5原始質(zhì)粒TIL32的構(gòu)建及鑒定。6重組質(zhì)粒PSNAV20IL32的構(gòu)建及鑒定。7病毒包裝細胞BHK21的復蘇，培養(yǎng)，傳代，凍存。8構(gòu)建重組腺相關(guān)病毒RAAV2IL32。9RAAV2IL32的大規(guī)模制備。10RAAV2IL32的目的基因的PCR鑒定。11RAAV2IL32的滴度測定。結(jié)果1RTPCR檢測IL32MRNA的結(jié)果正常皮膚、增生性瘢痕及瘢痕疙瘩組織中IL32MRNA均有表達。增生性瘢痕和瘢痕疙瘩與正常皮膚相比較IL32MRNA的表達明顯降低P＜005），而增生性瘢痕及瘢痕疙瘩組織中IL32MRNA的表達無明顯的差別P＞005）。2免疫組化檢測IL32蛋白結(jié)果IL32蛋白在三者中均有表達。但IL32蛋白在皮膚中表達較增生性瘢痕及瘢痕疙瘩組織中強差異有統(tǒng)計學意義P＜005而在增生性瘢痕及瘢痕疙瘩組織中表達無差異P＞005）。3WESTERNBLOTTING檢測IL32蛋白結(jié)果IL32蛋白在皮膚、增生瘢痕和瘢痕疙瘩三組中均有表達。與正常皮膚相比，增生性瘢痕及瘢痕疙瘩IL32蛋白的表達明顯降低P＜005。而在增生性瘢痕及瘢痕疙瘩組織中表達無差異（P＞005）。4應(yīng)用OVERLAPPINGPCR獲得目的基因片段經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳顯示擴增片斷約為570BP，與目的片斷大小基本符合，且無非特異性擴增。5質(zhì)粒TIL32經(jīng)用BGLⅡ和KPNⅠ雙酶切酶切后電泳見大約570BP片段，與目的片斷符合。6PSNAV20IL32質(zhì)粒經(jīng)KPNⅠ和BGLⅡ雙酶切預期能產(chǎn)生大小分別71KB和570BP左右兩條帶而電泳結(jié)果與預期相符，該質(zhì)粒經(jīng)酶切鑒定正確。720IL32質(zhì)粒轉(zhuǎn)染六孔板中的BHK21細胞，經(jīng)G418篩選后，取菌液經(jīng)PCR鑒定能夠特異地擴增出570BP左右大小的目的基因條帶。8RAAV2IL32大規(guī)模制備后，測病毒滴度約為521011VGML。結(jié)論1和正常皮膚相比，IL32MRNA和IL32蛋白增生性瘢痕和瘢痕疙瘩組織中均有下降，提示IL32基因在病理性瘢痕組織的形成中起著重要作用，IL32基因可能通過各種機制影響病理性瘢痕的發(fā)生發(fā)展。預示IL32基因?qū)⒊蔀椴±硇择：刍蛑委熜碌暮蜻x靶基因。2成功構(gòu)建了能表達人IL32基因的真核表達載體。3構(gòu)建了有較強感染能力的含人IL32基因的重組腺相關(guān)病毒載體。

簡介：背景SARSCONAVIRUSSARSCOV感染引起嚴重急性呼吸道綜合征SEVEREACUTERESPIRATYSYNDROME，SARS的全球爆發(fā)嚴重危害了人類健康和社會經(jīng)濟。對SARSCOV的研究主要集中于病原的致病機制、SARS的源頭和傳播途、防治藥物和疫苗的研制和開發(fā)。對于這種新現(xiàn)病毒，病毒抗原表位的研究是SARSCOV眾多研究的基礎(chǔ)。SARSCOVB細胞優(yōu)勢表位的確定及對其免疫學特性的研究將為SARS特異性診斷試劑的研制、疫苗和抗病毒藥物的設(shè)計與合成奠定基礎(chǔ)。目的篩選SARSCOVB細胞優(yōu)勢表位，對其進行特異性和敏感性檢測、抗體效價測定等一系列免疫學特性研究，分析各表位的潛在應(yīng)用前景，為SARS特異性診斷試劑、SARS疫苗和抗病毒藥物的研制奠定基礎(chǔ)。方法應(yīng)用隨機噬菌體展示肽庫，以SARS恢復期病人IGGFAB段及正常人IGGFAB段為篩選靶標，經(jīng)改良的生物淘洗方式，結(jié)合生物信息學方法，篩選SARSCOV特異性B細胞優(yōu)勢表位；人工合成表位多抗原肽MAPS，ELISA法檢測其特異性和敏感性；以表位肽免疫BALB／C小鼠，ELISA法檢測抗體效價和特異性，研究表位肽誘導的特異性體液免疫應(yīng)答；經(jīng)淋巴細胞增殖試驗、ELISPOT分析IL4和IFNΓ分泌細胞數(shù)目變化、流式細胞技術(shù)分析脾淋巴細胞亞群變化和表位肽誘導CD4T細胞產(chǎn)生的免疫記憶來研究表位肽誘導的特異性細胞免疫應(yīng)答；經(jīng)吞噬功能的檢測研究表位肽誘導的非特異性免疫應(yīng)答；通過ELISA法和噬菌體滴度測定觀察表位介導的吸附作用以及特異性抗體對吸附的阻斷作用。結(jié)果1經(jīng)過2次4輪改良的生物淘洗，共篩選到9個SARSCOVS蛋白表位和2個M蛋白表位。2經(jīng)生物信息學分析，其中的7個表位即S91102、S424435、S458469、S785796、S10651076、M148159、M165176分別為SARSCOVS和M蛋白B細胞優(yōu)勢表位。合成6個表位MAP肽MAPLMAP6，分別為S91102、S424435、S458469、S10651076、M148159和M165176作進一步研究。競爭抑制試驗結(jié)果顯示各表位肽均可抑制相應(yīng)的噬菌體克隆與SARS恢復期病人IGGFAB段結(jié)合，最大抑制率為54％～86％，表明這些表位肽與其相應(yīng)的噬菌體克隆可不同程度地競爭結(jié)合抗SARSCOVIGGFAB段的同一位點，證實了與抗SARSCOVIGGFAB段結(jié)合的表位肽的位點為SARSCOYB細胞表位。3免疫學特性研究1表位肽均能與SARS病人血清發(fā)生特異性反應(yīng)，不與正常人血清、抗人冠狀病毒OC43HCOVOC43血清和229EHCOV229E血清發(fā)生交叉反應(yīng)，具有SARSCOY特異性。與SARS病人血清反應(yīng)時，表位肽S458469，S91102，S10651076和M148159具有較高的敏感性。2表位肽誘導的特異性體液免疫應(yīng)答這些表位肽均能刺激小鼠產(chǎn)生高效價1∶1280～1∶5120特異性抗體，MAP1、MAP2、MAP4這3個S蛋白表位肽誘導產(chǎn)生的抗體效價高于M蛋白表位肽誘導者。這些抗體能特異地與SARSCOV滅活抗原反應(yīng)而不與HCOVOC43和HCOV229E抗原反應(yīng)。3表位肽誘導的特異性細胞免疫應(yīng)答①免疫第14天，小鼠脾臟B淋巴細胞明顯增生，T淋巴細胞相對減少，導致T／B比值明顯下降。隨T細胞增殖，T／B比值逐漸回復除MAP2組。發(fā)現(xiàn)MAP2免疫能引起短暫的T8細胞抑制，導致T4／T8比值明顯高于對照組，并于第21天恢復正常，其余多肽免疫組T4／T8與對照組相比無明顯差異，提示脾淋巴系統(tǒng)處于相對免疫穩(wěn)態(tài)。②首次免疫后8周，小鼠CD4T細胞出現(xiàn)CD44CD62L的記憶細胞表型，再次接觸相同抗原，MAP3免疫組CD4T細胞CD44表達輕微上調(diào)，其余組均輕微下調(diào)，隨后處于高表達狀態(tài)；CD62L表達連續(xù)上調(diào)，提示CD4T細胞免疫記憶形成。③各表位肽均可刺激淋巴細胞不同程度增生，最大刺激指數(shù)220％～476％。S蛋白表位肽刺激淋巴細胞增生的程度大于M蛋白表位肽刺激者。④各表位肽均能刺激IL4和IFNΓ分泌細胞增多，峰值分別為56～124個210個淋巴細胞和14～20個210個淋巴細胞，前者明顯多于后者。S蛋白表位肽刺激IL4分泌細胞多于M蛋白表位肽刺激者。4表位肽誘導的非特異性免疫應(yīng)答各表位肽均能增強小鼠腹腔巨噬細胞的吞噬功能。5展示SARSCOVS91102、S424435和S458469表位的噬菌體可不同程度地吸附VERO，VEROE6，MDCK，HEP2細胞，其特異性抗體可阻斷表位介導的吸附作用。結(jié)論本研究以SARS恢復期病人血清為篩選材料，應(yīng)用噬菌體展示肽技術(shù)，通過改良的生物淘洗方法，篩選出9個SARSCOVS蛋白表位和2個M蛋白表位，表明SARSCOVS蛋白和M蛋白為SARSCOV的重要抗原成分。結(jié)合生物信息學方法在篩得的11個表位中選擇6個優(yōu)勢表位，以ELISA、ELISPOT、流式細胞技術(shù)等免疫學方法研究這些表位的免疫學特性，結(jié)論如下各表位肽誘導的免疫應(yīng)答以體液免疫為主，刺激小鼠機體產(chǎn)生高效價抗體，證實這些表位為B細胞表位；其中S蛋白表位肽誘導的特異性抗體效價高于M蛋白表位肽誘導者，提示它們在表位疫苗或疫苗研制中的潛在應(yīng)用前景；所篩表位具有SARSCOV特異性，其中S458469、S91102、S10651076和M148159具有較高的敏感性，此外，抗表位肽抗體具有特異性，可通過制備高效價免疫血清或單克隆抗體MCAB用于特異性診斷，提示了這些表位在研制特異性診斷試劑中的潛在應(yīng)用價值；表位S91102、S424435和S458469可介導噬菌體對SARSCOV宿主細胞的吸附，其特異性抗體可阻斷吸附作用，提示它們可能為研究保護性疫苗和抗病毒藥物的潛在靶點。

簡介：流感是一種流感病毒引起的嚴重性呼吸道疾病。流感病毒INFLUENZAVNS，IV具有高度傳染性，能在短期內(nèi)突然發(fā)生，迅速蔓延，造成不同程度的流行，甚至世界大流行，導致全球人力資源和物力資源的重大損失。流感病毒的主要表面抗原之一血凝素HA，具有高度變異性，致使流感病毒疫苗一般每年都要更換，給疫苗的制備和生產(chǎn)造成了諸多不便。而流感病毒的跨膜蛋白一基質(zhì)蛋白2M2蛋白，含有高度保守的抗原表位，是病毒亞型間交叉保護性疫苗的候選抗原。流感病毒變異速度非常快，尤其是當前禽流感病毒逐漸蔓延到人群中，對人類危害越來越大，因此研制出一種新穎的具有廣泛保護作用的疫苗對于控制流感病毒流行具有極其重要的意義。本研究選擇了A型流感病毒的缺失跨膜區(qū)M2以及H1N1和H3N2亞型流感病毒HA的7個保守的B細胞表位和T細胞表位。采用大腸桿菌偏愛的密碼子對M2外膜區(qū)基因和HA多表位基因進行了優(yōu)化設(shè)計。通過合成引物，利用重疊延伸PCROEPCR和搭橋式PCR方法分別擴增得到A型流感病毒M2蛋白缺失跨膜區(qū)基因和HA多表位基因，依次克隆到表達載體中，構(gòu)建重組質(zhì)粒PET28AM2DHA，經(jīng)測序表明，插入表達載體中的外源基因的序列與理論設(shè)計的基因序列完全一致。將重組表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21DE3，篩選獲得了高效表達重組融合蛋白的工程菌，表達重組蛋白約占菌體總蛋白總量的45％左右。表達產(chǎn)物以包涵體形式存在，經(jīng)包涵體處理，親和層析純化后，重組蛋白稀釋復性，再經(jīng)陰離子交換層析純化得到純度在90％以上的目的蛋白。WESTEMBLOT結(jié)果顯示純化的重組蛋白具有較好的抗原性和特異性。重組蛋白免疫小鼠后，利用ELISA實驗檢測重組蛋白在小鼠體內(nèi)獲得了很高的抗體免疫水平；利用免疫熒光實驗觀察，重組蛋白抗血清對MDCK細胞上的流感病毒能夠產(chǎn)生很好的抗原性。本研究成功構(gòu)建了流感病毒M2DHA抗原多表位重組蛋白表達載體，在大腸桿菌中獲得了高效表達；通過基因工程獲取較高純度的M2DHA重組蛋白，同時對蛋白表達、純化復性等實驗條件進行了初步的探索；在昆明小鼠體內(nèi)，對該重組蛋白的免疫學效應(yīng)作了初步的研究，為進一步研究廣譜型流感病毒亞單位疫苗提供了很好的理論依據(jù)和實驗資料，也為流感病毒亞單位疫苗的開發(fā)及基礎(chǔ)研究奠定了一定的實驗基礎(chǔ)。

簡介：目的通過建立體外病毒性心肌炎VMC細胞模型，研究廣棗總黃酮TFCA的體外抗柯薩奇B組3型病毒CVB3作用及其作用機制，探究其作用靶點，為TFCA進一步開發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。方法采用差速貼壁法培養(yǎng)原代乳鼠心肌細胞，鏡下觀察心肌細胞搏動次數(shù)，使用ΑACTIN免疫組化法鑒定培養(yǎng)心肌細胞的純度；在細胞水平測定陽性藥鹽酸胍以及廣棗總黃酮的藥物毒性；以CVB3感染心肌細胞建立病毒性心肌炎細胞模型；MTT染色分析廣棗總黃酮對病毒感染后的HELA細胞及心肌細胞是否有保護作用；病毒繁殖抑制實驗比較不同分組間TCID50的差別以驗證廣棗總黃酮在HELA細胞及心肌細胞上的抗病毒活性；測定各實驗組心肌細胞培養(yǎng)上清液中心肌酶LDH、CKMB的變化；測定各實驗組心肌細胞培養(yǎng)上清液中腫瘤壞死因子TNFΑ含量的變化；運用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(yīng)測定心肌細胞內(nèi)病毒相關(guān)基因的表達。結(jié)果經(jīng)過在HELA細胞及心肌細胞水平的初篩，確定廣棗總黃酮具有保護心肌細胞免受CVB3病毒侵襲的作用。病毒繁殖抑制實驗顯示廣棗總黃酮的高、中劑量組TCID50與病毒對照組TCID50相差一個以上對數(shù)值；廣棗總黃酮能使心肌酶LDH、CKMB的釋放較病毒組顯著降低P＜005，還可抑制被病毒感染的心肌細胞TNFΑ的分泌；同時，廣棗總黃酮還可明顯抑制CVB3相關(guān)基因CMYC、TNFΑ、FAS的表達。結(jié)論通過建立病毒性心肌炎細胞模型，證實廣棗總黃酮在體外細胞培養(yǎng)物上具有抗CVB3病毒作用。

簡介：戊型肝炎HEPATITISE，HE是由戊型肝炎病毒HEPATITISEVIRUS，HEV引起的一種急性病毒性肝炎，主要經(jīng)糞一口途徑傳播，常因飲用水源被污染而導致暴發(fā)流行，散發(fā)病例呈現(xiàn)全球分布。在我國的很多地區(qū)都有HEV感染的報道，HE流行率在我國為172％左右，各省市分布不均，農(nóng)村HEV感染率高于城市。根據(jù)HEV各分離株基因序列的核苷酸同源性、氨基酸同源性的大小以及系統(tǒng)進化樹的分析，目前將世界上HEV主要分為4個基因型。臨床上急性HEV感染率占總?cè)丝诘?5％～1％，感染率隨年齡增加而增加，20歲左右達到感染高峰，發(fā)病者主要為青壯年，其臨床表現(xiàn)主要是肝炎病毒引起的黃疸、急性肝壞死等。一般呈良性經(jīng)過，但孕婦感染情況較重，死亡率高達15％N25％，是一種全國普遍流行、危害比較嚴重的疾病。HEV是無包膜單股正鏈RNA病毒。HEV基因組全長約72～76KB，由5’和3’非結(jié)構(gòu)區(qū)及3個相互重疊的編碼閱讀框OPENREADINGFRAMESFF1，F(xiàn)2和F3組成，基因組結(jié)構(gòu)較為復雜。其中F2編碼病毒衣殼蛋白，富含HEV重要抗原表位。HEV組織培養(yǎng)研究尚不成熟，目前的診斷主要是采用間接酶聯(lián)免疫吸附分析ELISA方法檢測血清中的抗體。但因為HEV感染窗口期或患者自身免疫功能以及檢測方法的特異性等原因都會給HEV診斷帶來不確定性；HEVRNA檢測是目前判斷HEV是否存在的標準之一，但由于HEV存在多種基因型，給臨床研究工作和疫苗的研制帶來了很多困難。鑒于此，本課題建立了一種快速、敏感、特異性強的巢式逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(yīng)NESTREVERSETRANIONPOLYMERASECHAINREACTION，NRTPCR方法，用于血清HEVRNA的定性檢測，并探討其在輔助臨床進行戊型肝炎早期診斷中的價值。研究目的1、了解近年戊型肝炎病毒感染患者的臨床特征及血清學特點；分析比較單純感染和重疊感染的戊型肝炎患者的血清學特征異同，闡明重疊感染的戊型肝炎患者病情的發(fā)展及預后情況。為HEV的臨床診治和進一步研究提供參考。2、建立巢式逆轉(zhuǎn)錄PCR擴增血清HEVRNA方法，評價其應(yīng)用于急性戊型肝炎患者血清HEVRNA檢測的臨床意義。研究方法1、收集667例戊型肝炎病毒HEV感染以及戊型肝炎病毒重疊感染患者的相關(guān)血清學指標并與乙型肝炎病毒HBV感染、丙型肝炎病毒HCV感染患者進行回顧性資料分析。診斷標準依據(jù)2000年西安中華醫(yī)學會傳染病與寄生蟲病學分會、肝病學分會聯(lián)合修訂的“病毒型肝炎防治方案”中的病毒型肝炎診斷標準。凡抗HEVIGM和或抗HEVIGG陽性，并具有急性病毒性肝炎的臨床表現(xiàn)和肝功能異常者，診斷為急性戊型肝炎。2、對GENBANK數(shù)據(jù)庫中的戊型肝炎病毒全基因組序列進行分析比對，并針對國內(nèi)流行的戊型肝炎病毒株序列，選擇位于F2的保守區(qū)域設(shè)計引物，建立NRTPCR方法，并檢測126例急性戊型肝炎患者、20例甲型肝炎患者、30例乙型肝炎患者和30例丙型肝炎患者血清中戊型肝炎病毒RNA，以30例健康獻血者作為對照組。全部樣品提取RNA后進行NRTPCR檢測HEVRNA，并與檢測抗HEVIGM的方法進行比較。研究結(jié)果1、HEV感染病例多分布在21～40歲年齡段；且女性多于男性。在HEV陽性患者中，青少年組與青年組、中年組，老年組在ALP項差異具有統(tǒng)計學意義。老年組HEV感染患者的各項指標都處于較高水平；HEV重疊感染患者的年齡高峰都是在21～40歲之間，低年齡組與高年齡組的多重感染率均較低。HEV感染組與HEVHBV重疊感染組比較，ALP、TBIL存在明顯差別，膽汁淤積增多，黃疸程度加深。HEV感染組與HEVHCV重疊感染組LDH差異顯著，肝細胞損傷明顯。2、126例急性戊型肝炎患者血清中有67例532％HEVRNA陽性。對照組血清HEVRNA檢測均為陰性。與血清抗HEVIGM檢測結(jié)果比較，HEVRNA檢測的總符合率為8091％102126，兩種方法的檢測結(jié)果具有良好的一致性。NRTPCR方法檢測HEVRNA與血清抗HEVIGM檢測方法存在明顯的差異，不能相互替代，而有一定的互補性。3例患者的首份血清檢測為HEVRNA陽性，但抗HEVIGM為陰性，系列追蹤檢測，都相繼出現(xiàn)抗HEVIGM。急性戊型肝炎患者血清HEVRNA的檢出多在發(fā)病的1～12天內(nèi)。研究結(jié)論1、HEV主要侵犯青壯年，隨著年齡的增長重疊感染的比例越高。老年人感染HEV的肝功能損害比年輕人嚴重；HEV陽性女性患者所占比例較多HEV重疊HBV感染后肝細胞損害加重，病情趨向重癥化。2、應(yīng)用巢式RTPCR方法能對急性散發(fā)戊型肝炎患者血清中的HEVRNA進行定性檢測，且有較高的特異性和敏感性。在臨床使用可以提高對HEV早期診斷的水平，具有一定的臨床應(yīng)用價值。

簡介：目的構(gòu)建腸道病毒71型雙中和抗原表位嵌合型人3型腺病毒載體，為人3型腺病毒衣殼嵌合載體的應(yīng)用及基因工程疫苗的研究奠定基礎(chǔ)。方法以前期構(gòu)建的人3型腺病毒骨架質(zhì)粒PBRAD△E3GFPSP70為模板，搭橋PCR擴增六鄰體不同超變區(qū)（HVR）同時嵌入EV71的SP55和SP70兩個中和表位的六鄰體突變基因片段HEXONSP55SP70，突變的六鄰體片段克隆入穿梭載體，酶切后與線性化的人3型腺病毒骨架質(zhì)粒PBRAD△E3GFP共同轉(zhuǎn)化大腸桿菌BJ5183，同源重組獲得陽性重組腺病毒質(zhì)粒PBRSP70SP55AD3EGF，經(jīng)PCR、酶切及測序鑒定并線性化后轉(zhuǎn)染AD293細胞拯救重組腺病毒。重組腺病毒經(jīng)大量擴增純化后，進行熱穩(wěn)定性實驗和生長穩(wěn)定性實驗分析病毒的特性，WESTERNBLOT和ELISA實驗分析嵌合表位在六鄰體上的表達及在重組腺病毒粒子表面的暴露情況之后，用重組腺病毒免疫BALBC小鼠，通過WESTERNBLOT，ELISA實驗檢測免疫小鼠的體液免疫反應(yīng)，微量中和實驗檢測抗血清體外中和EV71病毒的活性。結(jié)果在SP70嵌入六鄰體HVR1區(qū)的基礎(chǔ)上，SP55嵌入六鄰體HVR4區(qū)和HVR5區(qū)的重組腺病毒質(zhì)粒未能成功拯救出重組病毒，而SP55嵌入HVR2區(qū)成功拯救出重組腺病毒R1R2A3，而且沒有影響病毒的熱穩(wěn)定性和生長特性。SP55、SP70表位在六鄰體蛋白融合表達并且暴露在病毒粒子表面。重組腺病毒初次免疫小鼠即誘導出SP55、SP70表位特異性抗體，多次免疫后抗體應(yīng)答加強。重組腺病毒較SP70GST，SP55GST融合蛋白免疫小鼠誘導產(chǎn)生更高滴度的IGG抗體，并且重組腺病毒免疫的抗血清能夠體外中和EV71病毒感染。結(jié)論成功構(gòu)建表達雙中和抗原表位嵌合型人3型重組腺病毒，免疫小鼠后誘導出表位特異的體液免疫反應(yīng)，本實驗拓寬了六鄰體衣殼蛋白修飾的3型腺病毒作為多個外源表位展示載體工具的應(yīng)用，為其以后應(yīng)用于雙價或者多價疫苗打下了良好的基礎(chǔ)。

簡介：研究目的通過體內(nèi)外抗乙肝病毒實驗研究，評價中藥復方清肝排毒飲抗乙肝病毒的作用效果；通過抗免疫性肝損傷和化學性肝損傷的實驗研究，評價該復方對實驗性肝損傷的保護作用效果并探討其作用機制，為清肝排毒飲應(yīng)用于臨床治療慢性乙型肝炎進一步提供實驗依據(jù)。實驗內(nèi)容1、復方清肝排毒飲對小鼠的急性毒性試驗在小鼠急性毒性試驗研究，我們通過記錄動物中毒表現(xiàn)及死亡情況，測定不同濃度的清肝排毒飲對小鼠的毒副作用，從而確定試驗的劑量范圍。結(jié)果顯示，復方清肝排毒飲80GKGD劑量可能對小鼠影響較大，而40GKGD劑量下對小鼠可能影響較小，故本課題以下實驗所用劑量均在40GKGD劑量范圍以下進行。2、復方清肝排毒飲體內(nèi)外抗乙肝病毒實驗研究在體內(nèi)抗DHBV的實驗研究中，選擇由先天感染性鴨乙肝病毒為模型。分別于T、T、T、P各時間點采血，分離血清，用斑點雜交法測定血清中DHBV的載量變化。結(jié)果顯示，清肝排毒飲大、中劑量組均有不同程度抑制DHBVDNA作用，與拉米夫定組相比較無顯著差異性，停藥后反跳不明顯。在體外抗HBV的實驗研究中，采用2215細胞模型，以HBSAG、HBEAG作為藥物效果檢測指標，并用MTT法檢測藥物細胞毒性。結(jié)果顯示，清肝排毒飲對2215細胞的半數(shù)毒性濃度TC為4023MGML。復方清肝排毒飲對HBSAG，HBEAG的半數(shù)抑制濃度IC分別為145和074，顯示清肝排毒飲在體外無顯著的直接抑制乙肝病毒復制的作用。3、復方清肝排毒飲體內(nèi)抗免疫性肝損傷和化學性肝損傷的實驗研究體內(nèi)抗免疫性肝損傷作用研究采用刀豆蛋白ACONA所誘導的小鼠急性肝損傷模型，用清肝排毒飲大、小劑量組40GKG，20GKG進行治療，并與聯(lián)苯雙酯治療組為對照，檢測小鼠血清丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶ALT、腫瘤壞死因子TNFΑ和Γ干擾素IFNΓ含量，觀察肝組織病理改變。清肝排毒飲大劑量組小鼠ALT活性、IFNΓ和TNFΑ含量均明顯低于模型組，差異有顯著性意義P005；清肝排毒飲大劑量組肝臟病理改變明顯減輕。表明清肝排毒飲對CONA所致小鼠肝損傷具有較好的保護作用，抑制T淋巴細胞活化和IFNΓ、TNFΑ的釋放是其主要的作用機制。體內(nèi)抗化學肝損傷作用研究采用醋氨酚所導致的小鼠肝損傷模型，用清肝排毒飲大、中、小劑量組80GKG，40GKG，20GKG進行治療，并與聯(lián)苯雙酯治療組對照，檢測小鼠血清丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶ALT、超氧化物歧化酶SOD、谷胱甘肽GSH水平，觀察肝組織病理改變。清肝排毒飲大、中劑量組能顯著抑制小鼠血清ALT，升高SOD、GSH水平，與模型組比較，差異有顯著性意義P005；清肝排毒飲大、中劑量組肝臟病理改變明顯減輕。表明清肝排毒飲對醋氨酚所致小鼠化學性肝損傷具有較好的保護作用，作用機制與抗氧自由基損傷有關(guān)。結(jié)論清肝排毒飲有較好的抗鴨乙肝病毒和抗實驗性肝損傷作用，有著較好的應(yīng)用開發(fā)前景。