簡(jiǎn)介：●●後旦大擎碩士研究生論文ALS患者認(rèn)知功能損害及T影響因素的研究ASTUDYOFFEATURESANDRELATEDFACTORSOFCOGNITIVEFUNCTK。AMYOTROPHICLATERALSCLEROSISUNCTIONINATERALCLEROSIS培養(yǎng)單位復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院專(zhuān)業(yè)姓名神經(jīng)病學(xué)裴曉思學(xué)號(hào)052105309學(xué)位導(dǎo)師導(dǎo)師組成員碩士洪震朱國(guó)行喬凱教授教授副教授◆◆目錄常用神經(jīng)心理測(cè)驗(yàn)中英文對(duì)照表．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．3中文摘要．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．5英文摘要．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．7前言．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．9翮看．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．9第一部分．J．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．11資料與方法．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．11結(jié)果．．．．．．．．．．．．?．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．15討論．．．．．．?．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．17第二部分．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．20資料與方法．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．20結(jié)果．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．23討論．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．28第三部分．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．31資料與方法．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．31結(jié)果．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．32討論．．一．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．34參考文獻(xiàn)．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．36綜述．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．39致謝．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．51

簡(jiǎn)介：慢病毒介導(dǎo)的突變型DMDNK對(duì)乳腺癌細(xì)胞的殺傷作用THEKILLINGOFBREASTCANCERCELLBYLENTIVIRALCONSTRUCTSCONTAININGTHEMULTISUBSTRATEDEOXYRIBONUCLEOSIDEKINASEOFDROSOPHILAMELANOGASTERSUICIDEGENE導(dǎo)一級(jí)學(xué)科壁疸2E銎論文課題起止時(shí)間2QQ生旦二2Q生墨旦中國(guó)醫(yī)科大學(xué)遼寧2012年2月目錄一、摘要中文論文摘要1英文論文摘要3二、英文縮略語(yǔ)5三、論文前言6月U罱材料與方法7結(jié)果附論文圖片11討論14結(jié)論15參考文獻(xiàn)16四、附錄綜述19在學(xué)期間科研成績(jī)34致謝35個(gè)人簡(jiǎn)介36

簡(jiǎn)介：研究目的1描述老年臥床患者日常生活能力、社會(huì)活動(dòng)、認(rèn)知和并發(fā)癥的發(fā)生狀況。2明確臥床時(shí)間與老年臥床患者自理能力、社會(huì)活動(dòng)、認(rèn)知和并發(fā)癥的關(guān)系。3探討老年臥床患者臥床分級(jí)程度與自理能力、社會(huì)活動(dòng)、認(rèn)知和并發(fā)癥的關(guān)系。對(duì)象與方法對(duì)象成都市5所有老年科、干部科的醫(yī)院的老年住院臥床患者，抽取持續(xù)臥床時(shí)間大于1月的患者進(jìn)行調(diào)查研究。方法通過(guò)查閱文獻(xiàn)資料、專(zhuān)家評(píng)價(jià)及預(yù)調(diào)查修訂老年臥床休息調(diào)查表；調(diào)查表包括一般人口學(xué)特征、臥床相關(guān)特征、并發(fā)癥及社會(huì)活動(dòng)量表、LAWTON和BRODY制定的日常生活能力量表、認(rèn)知能力量表。以上量表曾經(jīng)用于老年人及臥床相關(guān)研究，有較好的信度和效度。本研究采用描述一相關(guān)性研究，抽樣方法因受患者來(lái)源限制等因素制約，采用方便抽樣法。對(duì)臥床時(shí)間大于1月的151位老年患者進(jìn)行自理能力、社會(huì)活動(dòng)、認(rèn)知及并發(fā)癥調(diào)查。研究步驟對(duì)自理能力、社會(huì)活動(dòng)、認(rèn)知的調(diào)查表的表面效度和重測(cè)信度的測(cè)評(píng)；面對(duì)面發(fā)放問(wèn)卷；數(shù)據(jù)收集和處理；采用SPSS100進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果1老年臥床患者日常生活能力低下、社會(huì)活動(dòng)缺乏、認(rèn)知障礙且并發(fā)癥較多。2老年患者持續(xù)臥床的時(shí)間不同其日常生活能力、社會(huì)活動(dòng)、認(rèn)知、并發(fā)癥的差異老年患者臥床時(shí)間不同日常生活能力之間有差異P0001，臥床時(shí)間越長(zhǎng)患者的日常生活能力障礙越明顯；臥床時(shí)間不同的患者的社會(huì)活動(dòng)之間存在差異P00001，臥床時(shí)間越長(zhǎng)患者的社會(huì)活動(dòng)缺乏越明顯；臥床時(shí)間不同的老年患者認(rèn)知之間有差異P00001，臥床時(shí)間越長(zhǎng)患者的認(rèn)知障礙越明顯。臥床時(shí)間不同的老年患者之間并發(fā)癥的發(fā)生有差異P00001，臥床時(shí)間越長(zhǎng)患者的并發(fā)癥越多。3臥床時(shí)間與自理能力、社會(huì)活動(dòng)、認(rèn)知、并發(fā)癥的關(guān)系臥床時(shí)間與日常生活能力評(píng)分呈正相關(guān)關(guān)系，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義R0340，P00001，即隨著臥床時(shí)間增長(zhǎng)，日常生活功能障礙加重；臥床時(shí)間與社會(huì)活動(dòng)評(píng)分呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義R0348，P00001，即隨著臥床時(shí)間增長(zhǎng)，社會(huì)活動(dòng)缺乏；臥床時(shí)間與認(rèn)知評(píng)分呈正相關(guān)關(guān)系，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義R0496，P00001，即隨著臥床時(shí)間增加，認(rèn)知障礙明顯；臥床時(shí)間與并發(fā)癥發(fā)生呈正相關(guān)關(guān)系，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義R0741，P00001，即隨著臥床時(shí)間增加，并發(fā)癥發(fā)生增加。4臥床分級(jí)本研究納入室內(nèi)生活需人扶持且大部分時(shí)間臥床及全天臥床兩級(jí)與自理能力、社會(huì)活動(dòng)、認(rèn)知、并發(fā)癥的關(guān)系臥床分級(jí)大部分時(shí)間臥床及全天臥床與日常生活能力正相關(guān)，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義R0355，P0001即全天臥床較大部分時(shí)間臥床，自理能力評(píng)分高，自理障礙增加；臥床分級(jí)與社會(huì)活動(dòng)為負(fù)相關(guān)，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義R0282，P00001，即全天臥床較大部分時(shí)間臥床，社會(huì)活動(dòng)評(píng)分降低，社會(huì)活動(dòng)障礙明顯；臥床分級(jí)與認(rèn)知正相關(guān)，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義R0296，P00001，即全天臥床較大部分時(shí)間臥床，認(rèn)知評(píng)分高，認(rèn)知功能障礙；臥床分級(jí)與并發(fā)癥之間正相關(guān)，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義R0186，P0022，即全天臥床較大部分時(shí)間臥床，并發(fā)癥發(fā)生增加。結(jié)論1結(jié)論和建議1老年臥床患者處于日常生活能力低下、社會(huì)活動(dòng)缺乏、認(rèn)知障礙和并發(fā)癥較多的狀況。社會(huì)、家庭、醫(yī)護(hù)人員應(yīng)該給予他們更多關(guān)注。2持續(xù)臥床時(shí)間不同的患者其社會(huì)活動(dòng)、日常生活能力、認(rèn)知和并發(fā)癥發(fā)生有明顯差異。3隨著老年人臥床時(shí)間的延長(zhǎng)，存在日常生活能力降低、社會(huì)活動(dòng)減少、認(rèn)知障礙和并發(fā)癥發(fā)生增加等特點(diǎn)，應(yīng)盡量減少臥床時(shí)間，改善其日常生活能力、社會(huì)活動(dòng)及認(rèn)知，減少并發(fā)癥。4不同的臥床分級(jí)室內(nèi)生活需人扶持大部分時(shí)間臥床與全天床上生活與日常生活能力、社會(huì)活動(dòng)、認(rèn)知、并發(fā)癥之間存在相關(guān)關(guān)系，即全天臥床較大部分時(shí)間臥床，有日常生活能力降低、社會(huì)活動(dòng)能力降低、認(rèn)知障礙及并發(fā)癥增加等特點(diǎn)。應(yīng)該盡量減少患者每日的臥床時(shí)間。2應(yīng)用意義1為臨床醫(yī)護(hù)人員及患者的家人認(rèn)識(shí)到臥床患者存在日常生活能力低下、社會(huì)活動(dòng)缺乏、認(rèn)知障礙和并發(fā)癥較多的狀況，使他們重視對(duì)老年臥床患者日常生活的護(hù)理、對(duì)其社會(huì)活動(dòng)的促進(jìn)、認(rèn)知狀況的評(píng)估、預(yù)防并發(fā)癥的發(fā)生提供依據(jù)。2為臨床工作中縮短老年患者持續(xù)臥床時(shí)間，將持續(xù)臥床變?yōu)殚g斷臥床以至應(yīng)該活動(dòng)的時(shí)間不再臥床提供參考。3為臨床工作中減少患者每日的臥床時(shí)間，變?nèi)炫P床為部分時(shí)間臥床提供參考。

簡(jiǎn)介：登革病毒（DENV）是一種蟲(chóng)媒病毒，主要是通過(guò)白紋伊蚊和埃及伊蚊進(jìn)行傳播，每年約有5000萬(wàn)528億人口受到感染。DENV感染可以引起登革熱（DF）和危及生命的登革出血熱（DHF）及登革休克綜合征DSS，其中DHFDSS是重癥的登革病毒感染，其主要的特征之一是血漿滲漏。目前普遍認(rèn)為DHFDSS的發(fā)病機(jī)制主要包括病毒毒力因素，抗體依賴(lài)性感染增強(qiáng)效應(yīng)（ADE），宿主因素，交叉反應(yīng)性T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫病理?yè)p傷以及細(xì)胞因子風(fēng)暴等。眾多發(fā)病機(jī)制的提出主要是因?yàn)槟Ｐ偷牟煌?，目前小鼠、人血管?nèi)皮細(xì)胞主要以人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVECS）作為研究DENV感染發(fā)病機(jī)制的主要模型，但小鼠模型的運(yùn)用并不能完全模擬人類(lèi)的感染情況，細(xì)胞模型則因作用因素單一也不能確切的反映感染癥狀。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)組織基底硬度是影響細(xì)胞功能的主要因素之一，正常生理?xiàng)l件下血管基底膜及下層基質(zhì)的彈性硬度值影響了多種與血管內(nèi)皮細(xì)胞生存、復(fù)制、遷徙和維持穩(wěn)態(tài)的重要生物學(xué)功能，不同彈性硬度條件下這些生物學(xué)功能水平差異較大。當(dāng)前利用聚丙烯酰胺凝膠構(gòu)建不同的組織硬度可以影響細(xì)胞的生物學(xué)功能，使其能夠更貼近生理環(huán)境。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)水凝膠模擬人血管內(nèi)皮細(xì)胞基底膜彈性硬度，使體外模型的建立能夠更貼近生理環(huán)境，為DENV發(fā)病機(jī)制的研究提供一個(gè)新的研究模型。目的利用水凝膠HYDROGEL模擬人類(lèi)血管內(nèi)皮細(xì)胞基底膜彈性硬度以登革病毒2型DENV2NGC株感染接種于水凝膠為基底的原代HUVECS觀(guān)察HUVECS在水凝膠與普通塑料培養(yǎng)瓶產(chǎn)生IL29的情況。方法1原代人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的分離、培養(yǎng)及鑒定從健康新生兒的臍帶中分離并培養(yǎng)原代HUVECS利用免疫組織化學(xué)法和流式細(xì)胞術(shù)鑒定所分離的細(xì)胞。2水凝膠的制備和細(xì)胞接種將原代HUVECS接種于丙烯酰胺與聚丙烯酰胺混合配制的水凝膠。3流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡及感染率以MOIMULTIPLICITYOFINFECTION10的DENV2NGC株感染HUVECS利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)48H細(xì)胞的凋亡率及病毒的感染率。4基因芯片檢測(cè)提取DENV2感染48H的接種于水凝膠和普通塑料瓶的原代HUVECS的總MRNA，送檢樣本進(jìn)行基因表達(dá)譜芯片的檢測(cè)。5實(shí)時(shí)定量PCRQRTPCR及雙抗體夾心ELISA法實(shí)驗(yàn)通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR及雙抗體夾心ELISA法驗(yàn)證基因芯片檢測(cè)相關(guān)基因的表達(dá)情況。結(jié)果DENV2NGC株感染培養(yǎng)于水凝膠的原代HUVECS48H利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)證實(shí)原代HUVECS的病毒感染率較低細(xì)胞凋亡率與水凝膠未感染組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；通過(guò)MRNA基因表達(dá)譜芯片、實(shí)時(shí)熒光定量PCR、雙抗體夾心ELISA法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)IL29的表達(dá)與普通塑料細(xì)胞培養(yǎng)瓶接種的原代臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞受到病毒感染存在差異。結(jié)論利用DENV2NGC株感染接種于水凝膠的臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞通過(guò)MRNA基因表達(dá)譜芯片檢測(cè)發(fā)現(xiàn)IL29的產(chǎn)生并且與體外正常培養(yǎng)條件下受到DENV2NGC株感染后存在差異可能為DENV的發(fā)病機(jī)制研究提供新的模型。

簡(jiǎn)介：腺病毒5型是一種十分有效的基因治療載體，廣泛應(yīng)用于體內(nèi)體外的基因治療實(shí)驗(yàn)。腺病毒5型能夠感染很多細(xì)胞，包括分裂細(xì)胞和靜止細(xì)胞。它的侵入機(jī)制主要包括兩個(gè)階段。首先，腺病毒以其KNOB蛋白和柯薩奇腺病毒受體（COXSACKIEADENOVIRUSRECEPT，CAR）結(jié)合，錨定在細(xì)胞表面；然后，其五鄰體基底部（PENTONBASE）再與整合素結(jié)合，整合素作為輔助分子介導(dǎo)了病毒內(nèi)吞進(jìn)入內(nèi)涵體小泡。整個(gè)過(guò)程中，KNOB起了粘附病毒的作用，五鄰體起了內(nèi)化病毒的作用，它們隔司其職，相互配合，兩者對(duì)腺病毒的感染至關(guān)重要。腺病毒用于基因治療的一個(gè)主要問(wèn)題是缺乏靶向性。為了解決這個(gè)問(wèn)題，一個(gè)經(jīng)常采用的策略是在KNOB上進(jìn)行靶向改造，使它不與CAR結(jié)合，而與目標(biāo)受體結(jié)合。為了研究KNOB的結(jié)構(gòu)與功能，本研究表達(dá)了KNOB，CAR并制備了KNOB的單克隆抗體。本研究利用大腸桿菌BL21DE3表達(dá)了KNOB蛋白。通過(guò)NI2NTA系統(tǒng)的純化，純度可達(dá)95％以上。同時(shí)，我們利用本實(shí)驗(yàn)室昆蟲(chóng)細(xì)胞表達(dá)的CAR蛋白，ELISA結(jié)果顯示，兩者有著明顯的結(jié)合，提示所表達(dá)的KNOB至少有部分是維持了天然的構(gòu)象?？筀NOB單克隆抗體的制備，除了可以用于KNOB改造的研究外，還可以用于常規(guī)腺病毒5型的檢測(cè)及其相關(guān)研究。

簡(jiǎn)介：目的人呼吸道合胞病毒HUMANRESPIRATYSYNCYTIALVIRUS，RSV廣泛流行于世界各地，是嬰幼兒下呼吸道感染的最重要病原。目前尚無(wú)安全、有效的疫苗用于預(yù)防RSV感染。RSV兩個(gè)重要的糖蛋白膜表面表達(dá)的融合蛋白FFUSIONPROTEIN，F(xiàn)和粘附蛋白G，是激發(fā)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體的主要蛋白，也是疫苗研究發(fā)展的重要內(nèi)容。與G蛋白相比，F(xiàn)蛋白有更多的抗原識(shí)別位點(diǎn)，不同亞型間F蛋白高度保守、同源性高達(dá)86％，能刺激機(jī)體產(chǎn)生體液免疫及細(xì)胞免疫應(yīng)答，針對(duì)F的中和抗體具有交叉保護(hù)作用，是RSV疫苗研究的最重要的靶抗原。輔助病毒依賴(lài)型腺病毒載體HELPERDEPENDENTADENOVIRALVECT，HDAD主要用于基因治療研究，作為疫苗載體的研究起步較晚，尚沒(méi)有作為黏膜基因釋放系統(tǒng)用于疫苗研究的報(bào)道。HDAD與腺病毒具有相同的細(xì)胞嗜性，對(duì)呼吸道上皮細(xì)胞具有高效感染的能力，且能長(zhǎng)期、持續(xù)表達(dá)轉(zhuǎn)基因，具有重要的研究與使用價(jià)值。本研究擬構(gòu)建可表達(dá)A亞型RSVF蛋白的輔助病毒依賴(lài)型腺病毒載體HDADF，并完成大量制備、純化和F蛋白的體外表達(dá)鑒定，為進(jìn)一步的體內(nèi)免疫效果和免疫保護(hù)作用研究奠定基礎(chǔ)。方法將帶有CMV啟動(dòng)子序列的F基因亞克隆至克隆載體PSC11，鑒定正確后，克隆至HDAD質(zhì)粒PSC15B，構(gòu)建PSC15BFHDAD重組質(zhì)粒，PMEⅠ消化PSC15BF去除原核復(fù)制元件及抗性基因，獲得HDADFDNA分子，經(jīng)磷酸鈣共沉淀法轉(zhuǎn)染293CRE4細(xì)胞，16H后感染輔助病毒，收獲HDADF載體粗提液，隨后以HDADF粗提液及輔助病毒連續(xù)共感染293CRE4細(xì)胞直至HDADF達(dá)到復(fù)制極限，同時(shí)以可表達(dá)Β半乳糖苷酶ΒGALACTOSIDASE，LACZ報(bào)告基因的HDADLACZ載體作為平行對(duì)照監(jiān)測(cè)載體復(fù)制過(guò)程。大量制備HDADF，CSCL密度梯度及等密度梯度兩次超速離心純化，利用分子生物學(xué)技術(shù)體外鑒定HDADF表達(dá)情況。結(jié)果成功構(gòu)建了可表達(dá)RSVF蛋白的HDADF載體，通過(guò)與輔助病毒共感染293CRE4細(xì)胞及CSCL梯度法超速離心制備了大量純化的HDADF載體，透射電鏡觀(guān)察顯示HDAD的直徑約為70NM，具有典型的腺病毒形態(tài)，運(yùn)用分光光度測(cè)定法分析表明純化后HDAD載體顆粒濃度為7410VPML，體外感染293細(xì)胞，RTPCR檢測(cè)到F基因有轉(zhuǎn)錄，WESTERNBLOT分析表明F蛋白有特異性表達(dá)。結(jié)論成功構(gòu)建HDADF載體并在真核細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)表達(dá)，為體內(nèi)免疫學(xué)效力試驗(yàn)奠定基礎(chǔ)，為研制RSV疫苗提供了一種新方法。

簡(jiǎn)介：目的在持續(xù)表達(dá)HBV的HEPG2215細(xì)胞模型及PBSHBV13瞬時(shí)轉(zhuǎn)染細(xì)胞模型中觀(guān)察HBV復(fù)制對(duì)HEPG2細(xì)胞內(nèi)核酸識(shí)別受體及相關(guān)分子表達(dá)的影響；比較HBV（）肝癌組織與HBV（）肝癌組織IFI16的表達(dá)差異，并探討HBV復(fù)制與細(xì)胞內(nèi)DNA識(shí)別受體IFI16的相互作用及其機(jī)制。方法1提取HEPG2及HEPG2215細(xì)胞總RNA，RTQPCR檢測(cè)核酸識(shí)別受體及相關(guān)分子的表達(dá)；2采用PBSHBV13質(zhì)粒轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞系（HEPG2，HUH7），分別在不同時(shí)間點(diǎn)提取細(xì)胞總RNA，RTQPCR檢測(cè)核酸識(shí)別受體及相關(guān)分子的表達(dá)；3采用IHC及RTQPCR檢測(cè)HBSAG（）與HBSAG（）肝癌患者肝組織及外周血白細(xì)胞IFI16表達(dá)；RTQPCR，WESTERNBLOT，IF及激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)IFI16在HEPG2215細(xì)胞和HEPG2細(xì)胞中的表達(dá)及分布模式；4采用PBSHBV13質(zhì)粒轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞系（HEPG2，HUH7），在0H，12H，24H，36H，48H后分別提取細(xì)胞總RNA及蛋白，RTQPCR及WESTERNBLOT檢測(cè)IFI16的表達(dá)；ELISA檢測(cè)細(xì)胞上清中HBSAG和HBEAG表達(dá)水平；5采用不同濃度IFI16FL與PBSHBV13質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEPG2細(xì)胞，ELISA檢測(cè)細(xì)胞上清中HBSAG和HBEAG表達(dá)水平；RTQPCR檢測(cè)細(xì)胞上清中HBVDNA水平；同樣方法檢測(cè)HEPG2215細(xì)胞過(guò)表達(dá)IFI16對(duì)HBV復(fù)制和表達(dá)的影響；6比較HBSAG（）與HBSAG（）肝癌患者外周血白細(xì)胞中IFI16，IRF3，IFNΒ，NFΚB等的表達(dá)情況；IFI16FL與PBSHBV13質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEPG2細(xì)胞或IFI16FL單獨(dú)轉(zhuǎn)染HEPG2215細(xì)胞，RTQPCR檢測(cè)細(xì)胞中IFI16，IRF3，IFNΒ，NFΚB等表達(dá)情況。結(jié)果1RTQPCR檢測(cè)結(jié)果表明，與HEPG2細(xì)胞相比，HEPG2215細(xì)胞中上調(diào)的基因包括RIGI，MDA5和MYD88等；下調(diào)的基因包括IFNΒ，IRF3和IFI16等；2PBSHBV13質(zhì)粒轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞系（HEPG2，HUH7）后可以啟動(dòng)短暫的固有免疫應(yīng)答，激活RIGI，IFI16等核酸識(shí)別受體一過(guò)性升高；3IHC結(jié)果顯示HBSAG（）肝癌組織中IFI16蛋白呈陰性表達(dá)，HBSAG（）肝癌組織中呈中度陽(yáng)性表達(dá)；HBSAG（）組外周血白細(xì)胞中IFI16MRNA水平亦低于HBSAG（）組；HEPG2215細(xì)胞中IFI16MRNA的表達(dá)水平顯著低于HEPG2細(xì)胞，IFI16蛋白表達(dá)量與HEPG2細(xì)胞相比也顯著降低，其表達(dá)均在細(xì)胞核內(nèi)；4PBSHBV13質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEPG2和HUH7后，WESTERNBLOT和RTQPCR檢測(cè)顯示IFI16的MRNA及蛋白表達(dá)水平隨時(shí)間延長(zhǎng)而遞減；ELISA結(jié)果顯示細(xì)胞培養(yǎng)上清中HBSAG和HBEAG的分泌隨時(shí)間延長(zhǎng)而遞增；5隨著轉(zhuǎn)染IFI16真核表達(dá)質(zhì)粒的增加，HEPG2細(xì)胞上清中HBVDNA及HBSAG和HBEAG含量逐漸下降，HEPG2215細(xì)胞中檢測(cè)到相似作用；6共轉(zhuǎn)染IFI16FL與PBSHBV13質(zhì)粒后RTQPCR檢測(cè)HEPG2細(xì)胞中IRF3，IFNΒ，NFΚB等基因的表達(dá)相對(duì)上調(diào)；HEPG2215細(xì)胞轉(zhuǎn)染IFI16FL質(zhì)粒后上述基因的表達(dá)亦相對(duì)上調(diào)。結(jié)論1HEPG2細(xì)胞與持續(xù)表達(dá)HBV的HEPG2215細(xì)胞之間以及轉(zhuǎn)染與未轉(zhuǎn)染PBSHBV13質(zhì)粒的肝癌細(xì)胞系之間核酸識(shí)別受體及相關(guān)分子的表達(dá)存在差異，這些差異表達(dá)的分子有可能與HBV持續(xù)感染的發(fā)生相關(guān)；2瞬時(shí)轉(zhuǎn)染和持續(xù)表達(dá)HBV的肝癌細(xì)胞系中IFI16表達(dá)下調(diào)，提示HBV復(fù)制對(duì)IFI16的表達(dá)具有抑制作用，IFI16過(guò)表達(dá)亦可能通過(guò)IFI16STINGIRF3IFNΒ信號(hào)通路抑制HBV復(fù)制。本研究的創(chuàng)新點(diǎn)及意義1發(fā)現(xiàn)IFI16具有可抑制HBV復(fù)制與蛋白表達(dá)的效應(yīng)，提示IFI16具有抗HBV的固有免疫功能并可能通過(guò)IFI16STINGIRF3IFNΒ信號(hào)通路發(fā)揮作用；2HBV復(fù)制對(duì)IFI16表達(dá)具有抑制作用，這可能是HBV逃逸機(jī)體固有免疫應(yīng)答而導(dǎo)致慢性感染的機(jī)制之一。

簡(jiǎn)介：目的柯薩奇病毒B組3型COXSACKIEVIRUSGROUPBTYPE3CVB3感染所致的病毒性心肌炎VIRALMYOCARDITISVMC嚴(yán)重危害人類(lèi)健康，也是新生兒猝死的重要原因，目前尚無(wú)有效的預(yù)防方法。VP1是CVB3的主要中和抗原，能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生體液和細(xì)胞免疫。以質(zhì)粒為載體構(gòu)建的CVB3VP1基因疫苗免疫小鼠后，雖可誘導(dǎo)產(chǎn)生低效價(jià)的中和抗體，但不能有效阻止致死量病毒感染。因此，提高免疫原性、增強(qiáng)免疫效果是CVB3VP1疫苗亟需解決的問(wèn)題。目前提高免疫效果的關(guān)鍵因素之一是開(kāi)發(fā)具有較高基因轉(zhuǎn)移率和靶向特異性的轉(zhuǎn)基因載體。在眾多載體體系中，復(fù)制缺陷型腺病毒載體系統(tǒng)（REPLICATIONDEFECTIVEADENOVIRUSVECTSYSTEM以其廣泛的宿主范圍、極高的轉(zhuǎn)染效率以及外源基因高表達(dá)等特點(diǎn)，在疫苗載體選擇中表現(xiàn)出優(yōu)勢(shì)，成為極具應(yīng)用前景的基因轉(zhuǎn)移載體。盡管腺病毒載體有較高的轉(zhuǎn)染人體細(xì)胞的能力，但表達(dá)的蛋白如不能很快地穿梭和擴(kuò)散到更多的免疫活性細(xì)胞，仍不能有效提高抗原提呈效率。因此基因預(yù)防的又一關(guān)鍵是使受染細(xì)胞表達(dá)的抗原蛋白能有效地?cái)U(kuò)散到免疫活性細(xì)胞。VP22是I型單純皰疹病毒UL49基因編碼的長(zhǎng)301個(gè)氨基酸的堿性蛋白質(zhì)，具有蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域PROTEINTRANSDUCTIONDOMAIN，PTD，能夠把與之融合的蛋白或與之結(jié)合的DNA等大分子跨膜送遞到鄰近細(xì)胞。利用這一特性，將與VP22融合的抗原送遞到周?chē)拿庖呋钚约?xì)胞，提高其抗原的提呈效率，可望顯著增強(qiáng)疫苗的免疫原性。本研究以CVB3為對(duì)象，利用ADEASY腺病毒載體系統(tǒng)構(gòu)建、包裝重組腺病毒RADVP22LVP1和RADVP1，并觀(guān)察它們?cè)?93細(xì)胞中的表達(dá)，為構(gòu)建用于人類(lèi)的CVB3疫苗奠定基礎(chǔ)。方法1目的基因的擴(kuò)增與鑒定以編碼VP22蛋白的質(zhì)粒PAP85H為模板，擴(kuò)增VP22LINKER基因。以編碼VP1蛋白的質(zhì)粒PCDNA3VP1為模板，擴(kuò)增VP1和LINKERVP1基因。將上述3種擴(kuò)增產(chǎn)物分別與PGEMT載體連接，轉(zhuǎn)化DH5Α大腸桿菌，構(gòu)建質(zhì)粒PGEMTVP22L、PGEMTVPL和PGEMTLVP1。提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定和測(cè)序，篩選重組子。2重組穿梭質(zhì)粒的構(gòu)建將上述3種質(zhì)粒以合適的限制性?xún)?nèi)切酶進(jìn)行雙酶切，回收帶粘末端的3種目的片段，將VP1、VP22LINKER和LINKERVP1分別與經(jīng)相應(yīng)限制性?xún)?nèi)切酶雙酶切的腺病毒穿梭載體PADTRACKCMV連接，經(jīng)轉(zhuǎn)化、篩選和酶切鑒定，構(gòu)建重組穿梭質(zhì)粒ADTRACKCMVVP1和ADTRACKCMVVP22LVP1。3重組腺病毒質(zhì)粒的構(gòu)建將PADTRACKCMV、ADTRACKCMVVP1和ADTRACKCMVVP22LVP13種質(zhì)粒分別用內(nèi)切酶PMEI線(xiàn)性化。利用ADEASY系統(tǒng)，經(jīng)兩步法分別在大腸桿菌BJ5183中與骨架載體PADEASY1同源重組，構(gòu)建重組腺病毒質(zhì)粒PAD、PADVP1和PADVP22LVP1。經(jīng)PACI酶切，PCR鑒定后，將陽(yáng)性質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入感受態(tài)ECOLIDH5Α，挑取陽(yáng)性克隆。以堿裂解法大量提取3種重組質(zhì)粒，并用聚乙二醇POLYETHYLENEGLYCOL，PEG沉淀法進(jìn)行純化。4重組腺病毒的包裝與擴(kuò)增以上重組腺病毒質(zhì)粒分別用內(nèi)切酶PACⅠ線(xiàn)性化，以陽(yáng)離子脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染HEK293HUMANEMBRYOKIDNEY293DERIVEDCELLLINE細(xì)胞，并觀(guān)察報(bào)告基因綠色熒光蛋白GREENFLUESCENTPROTEINGFP的表達(dá)。凍融法收集初代病毒液。取初代病毒液感染293細(xì)胞，逐日觀(guān)察細(xì)胞病變CYTOPATHICEFFECTCPE，及有無(wú)彗星樣斑塊FOCI形成。并經(jīng)三至四輪傳代擴(kuò)增，提高病毒滴度。5病毒感染后48小時(shí)，提取細(xì)胞總蛋白，通過(guò)WESTERNBLOT檢測(cè)病毒蛋白的表達(dá)。6重組腺病毒滴度測(cè)定待293細(xì)胞在96孔板中生長(zhǎng)至7080％匯合時(shí)，以系列稀釋的上述各代病毒液感染細(xì)胞，感染后48小時(shí)GFP陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)法測(cè)定病毒滴度。病毒滴度熒光細(xì)胞數(shù)病毒液的稀釋倍數(shù)病毒液量PFUML結(jié)果1成功構(gòu)建PGEMTVP22L、PGEMTVP1和PGEMTLVP1，采用DNA測(cè)序和雙酶切，證實(shí)這3段基因片段均與報(bào)道的基因序列一致。2成功構(gòu)建穿梭質(zhì)粒ADTRACKCMVVP1和ADTRACKCMVVP22LVP1，限制酶切分析證明均與預(yù)期相符。3成功構(gòu)建重組腺病毒質(zhì)粒PAD、PADVP1和PADVP22LVP1，用PACⅠ酶切得到約30KB的片段和一個(gè)30KB或45KB的小片段，PCR鑒定目的基因長(zhǎng)度均與預(yù)期值相符。4轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，熒光顯微鏡下可觀(guān)察到293細(xì)胞有報(bào)告基因GFP的表達(dá)，表明重組腺病毒RAD、RADVP1和RADVP22LVP1包裝成功。初代病毒液再次感染293細(xì)胞，在熒光顯微鏡下可逐日觀(guān)察到細(xì)胞病變和熒光聚集，各代病毒液感染細(xì)胞后均有特征性彗星樣熒光斑塊形成。5重組腺病毒重新感染293細(xì)胞48小時(shí)后，提取細(xì)胞蛋白，經(jīng)WESTERNBLOT檢測(cè)，VP1、VP22LVP1蛋白均有表達(dá)。6感染48小時(shí)后在熒光顯微鏡下觀(guān)察，各組病毒滴度為RAD初代至第四代病毒滴度分別為12105PFUML、407106PFUML、147107PFUML和96107PFUML。RADVP1初代至第四代病毒滴度分別為267105PFUML、182100PFUML、367100PFUML和16107PFUML。RADVP22LVP1初代至第四代病毒滴度分別為253105PFUML、153100PFUML、140107PFUML和677107PFUML。結(jié)論1成功構(gòu)建并包裝重組腺病毒RAD、RADVP1和RADVP22LVP1，體外感染293細(xì)胞可見(jiàn)VP1及VP22和VP1融合蛋白的表達(dá)。2經(jīng)第三、第四輪擴(kuò)增，每升高一代可使病毒滴度增加約10倍。3本研究利用ADEASY腺病毒載體系統(tǒng)成功包裝了重組腺病毒載體疫苗RADVP22LVP1和RADVP1，為發(fā)展新型的CVB3載體疫苗奠定基礎(chǔ)。

簡(jiǎn)介：情感是人類(lèi)最重要的生命體驗(yàn)，而“愛(ài)”是最神圣最崇高的情感。可以說(shuō)，“愛(ài)”是一種高度抽象的復(fù)雜概念，“LOVE愛(ài)”這一詞語(yǔ)相對(duì)其他詞語(yǔ)來(lái)說(shuō)有著最為豐富的涵義。因此，人們通常借助具體的有形的事物描述“愛(ài)”的情感。自從20世紀(jì)80年代以來(lái)，中外許多學(xué)者對(duì)人類(lèi)的各種情感做了大量研究，其中對(duì)“愛(ài)”的研究尤其重視，只是大部分著作和研究都把“愛(ài)”作為愛(ài)情來(lái)闡釋?zhuān)聦?shí)上“ILOVEYOU我愛(ài)你”不僅僅被用于愛(ài)人之間，也被廣泛用于表達(dá)親情和友情美國(guó)傳統(tǒng)英語(yǔ)字典1982。親情和友情中的愛(ài)也是人類(lèi)情感中不可缺少的部分，可是在以往的研究中卻被忽略了。國(guó)外語(yǔ)言學(xué)界對(duì)“愛(ài)”隱喻的研究文獻(xiàn)頗豐，但也是主要集中在將“愛(ài)”隱喻界定為愛(ài)情隱喻的研究。國(guó)內(nèi)對(duì)此的研究還不夠深入。本文以“愛(ài)”的概念隱喻為研究對(duì)象，將“愛(ài)”分為愛(ài)情，親情和友情這三個(gè)涵義，從認(rèn)知語(yǔ)言學(xué)視角對(duì)“愛(ài)”隱喻進(jìn)行比較詳細(xì)的研究，旨在發(fā)掘英漢“愛(ài)”的概念隱喻的共性和差異，因此，本文擬對(duì)下面三個(gè)問(wèn)題作出回答1什么是“愛(ài)”隱喻2從中英歌曲中搜集的語(yǔ)料可以歸納出中英“愛(ài)”隱喻有什么共性和差異3這種共性和差異的背后原因是什么本文首先分類(lèi)分析語(yǔ)料，根據(jù)愛(ài)情，親情和友情這三個(gè)涵義分別歸納總結(jié)出中英歌曲中“愛(ài)”的隱喻，以這三種涵義之間的關(guān)系為依托，詳細(xì)分析這三種涵義的“愛(ài)”隱喻之間所呈現(xiàn)出來(lái)的共性和差異，研究發(fā)現(xiàn)，在表達(dá)愛(ài)情的“愛(ài)”隱喻中，英漢語(yǔ)有許多相同的“愛(ài)”隱喻，例如英漢語(yǔ)中都有愛(ài)是戰(zhàn)爭(zhēng)，愛(ài)是物體愛(ài)是珍貴的物體愛(ài)是瘋狂等等同時(shí)，英漢語(yǔ)各自又有獨(dú)特的“愛(ài)”概念隱喻，如在英語(yǔ)中有愛(ài)是合二為一（兩個(gè)互補(bǔ)的部分組成整體），愛(ài)是太陽(yáng)等，在漢語(yǔ)中有愛(ài)是緣分，愛(ài)是絲綢，愛(ài)是合二為一（兩個(gè)不分離的個(gè)體組成陰陽(yáng)一對(duì)，愛(ài)是月亮等。在表達(dá)親情的“愛(ài)”隱喻中，情況也是一樣，存在共性和差異。相同的親情“愛(ài)”隱喻有愛(ài)是旅程愛(ài)是商品，愛(ài)是滋養(yǎng)品，愛(ài)的對(duì)象是珍貴的物體，愛(ài)是機(jī)器等等英語(yǔ)中特有的是與上帝有關(guān)的愛(ài)隱喻，愛(ài)是太陽(yáng)或光，漢語(yǔ)中特有與佛教有關(guān)的愛(ài)隱喻，愛(ài)是絲或棉，愛(ài)是恩惠，愛(ài)是月亮等。在表達(dá)友情的“愛(ài)”隱喻中相同的“愛(ài)”隱喻有愛(ài)是擁有的物體愛(ài)是商品，愛(ài)是管道等同時(shí)，中英友情的愛(ài)隱喻中也各自存在不同的隱喻，例如，英語(yǔ)中有愛(ài)是太陽(yáng)或光，漢語(yǔ)中有愛(ài)是緣分，愛(ài)是絲或紐帶等。由此可見(jiàn)，愛(ài)情，親情和友情中都同樣呈現(xiàn)了英漢語(yǔ)“愛(ài)”隱喻的共性和差異。本文從身體經(jīng)驗(yàn)和生活經(jīng)驗(yàn)方面對(duì)存在共性的原因進(jìn)行分析，從自然環(huán)境，文化背景方面對(duì)產(chǎn)生差異的原因進(jìn)行分析，其中文化背景包括對(duì)宗教信仰，不同的社會(huì)歷史發(fā)展軌跡，思想哲學(xué)基礎(chǔ)和世界觀(guān)、價(jià)值觀(guān)等的分析。更好地了解這種共性和差異背后的深層思維認(rèn)知原因，文化和社會(huì)原因?；谝陨嫌懻摚疚膹恼J(rèn)知語(yǔ)言學(xué)的視角從一個(gè)新角度為“愛(ài)”隱喻的研究提供了支持并豐富了“愛(ài)”隱喻的研究。對(duì)英語(yǔ)學(xué)習(xí)者、翻譯工作者以及跨文化交流具有參考價(jià)值。

簡(jiǎn)介：目的1分析老年人睡眠質(zhì)量與認(rèn)知功能的相關(guān)關(guān)系2探討自我按摩訓(xùn)練對(duì)老年人睡眠質(zhì)量及認(rèn)知功能的效果。方法本研究為現(xiàn)場(chǎng)實(shí)驗(yàn)性研究。選取長(zhǎng)沙市某社區(qū)老年人82人隨機(jī)分為對(duì)照組和自我按摩組對(duì)照組40人自我按摩組42人對(duì)照組給予睡眠知識(shí)健康宣教在對(duì)照組基礎(chǔ)上自我按摩組給予自我按摩訓(xùn)練實(shí)施干預(yù)共6個(gè)月。分別于干預(yù)前、干預(yù)三個(gè)月末、干預(yù)六個(gè)月末運(yùn)用匹茨堡睡眠質(zhì)量指數(shù)PSQI、愛(ài)潑沃斯嗜睡量表ESS、簡(jiǎn)易精神狀態(tài)量表MMSE、韋氏記憶量表中國(guó)修訂版WMSRC中背數(shù)、圖片記憶、聯(lián)想記憶、理解記憶四個(gè)分量表對(duì)研究對(duì)象的睡眠質(zhì)量及認(rèn)知功能進(jìn)行調(diào)查。采用SPSS170統(tǒng)計(jì)軟件建立數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)資料進(jìn)行統(tǒng)計(jì)描述、卡方檢驗(yàn)、非參數(shù)秩和檢驗(yàn)和重復(fù)測(cè)量方差分析等統(tǒng)計(jì)方法。Α值取005P值均為雙側(cè)概率。結(jié)果1基線(xiàn)調(diào)查結(jié)果顯示82例老年人PSQI、ESS得分分別為889±394、470±380MMSE得分為2377±364韋氏記憶量表的背數(shù)、圖片記憶、聯(lián)想記憶、理解記憶得分分別為926±180、808±362、220±133、513±301。2相關(guān)分析顯示MMSE得分與PSQI、ESS得分呈負(fù)相關(guān)P＜005并且MMSE得分與PSQI因子中主觀(guān)睡眠質(zhì)量、入睡時(shí)間、睡眠時(shí)間、睡眠效率、睡眠障礙呈負(fù)相關(guān)P＜005通過(guò)多元線(xiàn)性回歸分析老年人MMSE得分的影響因素年齡、教育水平、PSQI、ESS被納入回歸方程相關(guān)系數(shù)分別為0157、1476、0214、0183決定系數(shù)為0434方程具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義P＜001。3干預(yù)前后資料進(jìn)行重復(fù)測(cè)量方差分析顯示PSQI、ESS、MMSE以及韋氏記憶量表四個(gè)維度得分在干預(yù)主效應(yīng)和交互作用上均存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異0＜005除背數(shù)外其余各變量在時(shí)間主效應(yīng)上存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義P＜005。結(jié)論1老年人認(rèn)知功能的主要影響因素有年齡、教育水平、PSQI得分、ESS得分教育水平與認(rèn)知功能呈正相關(guān)而年齡、PSQI得分、ESS得分與認(rèn)知功能呈負(fù)相關(guān)。2自我按摩訓(xùn)練能有效改善老年人的睡眠質(zhì)量和認(rèn)知功能。

簡(jiǎn)介：本文對(duì)社區(qū)護(hù)士與臨床護(hù)士對(duì)優(yōu)質(zhì)護(hù)理認(rèn)知進(jìn)行了比較研究。文章采用便利抽樣法，抽取三所大學(xué)臨床醫(yī)院的臨床護(hù)士350名及16個(gè)省市的社區(qū)衛(wèi)生服務(wù)機(jī)構(gòu)的社區(qū)護(hù)士200名作為研究對(duì)象，用自行編制的問(wèn)卷進(jìn)行調(diào)查。所有的數(shù)據(jù)利用SPSSFWINDOWS130統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行了分析。研究表明臨床護(hù)士和社區(qū)護(hù)士對(duì)本研究所給出的優(yōu)質(zhì)護(hù)理屬性認(rèn)同度頗高，表明了護(hù)士普遍認(rèn)同這些詞句能從不同方面詮釋優(yōu)質(zhì)護(hù)理的內(nèi)涵；臨床護(hù)士和社區(qū)護(hù)士對(duì)優(yōu)質(zhì)護(hù)理屬性的認(rèn)同度均有顯著性差異，臨床護(hù)士的認(rèn)同度高于社區(qū)護(hù)士；護(hù)士的年齡、護(hù)齡、學(xué)歷、月薪等，都對(duì)護(hù)士對(duì)優(yōu)質(zhì)護(hù)理的認(rèn)同產(chǎn)生影響，其中以學(xué)歷對(duì)護(hù)士對(duì)優(yōu)質(zhì)護(hù)理認(rèn)知的影響最大。

簡(jiǎn)介：心肌梗死MYOCARDAILINFARCTION，MI是冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病簡(jiǎn)稱(chēng)冠心病患者嚴(yán)重的心臟事件，其后的心室重構(gòu)可導(dǎo)致心力衰竭、心跳驟停、惡性室性心律失常甚至心源性猝死，嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康。如何有效防治MI后心室重構(gòu)一直是心血管基礎(chǔ)與臨床研究的重點(diǎn)和熱點(diǎn)。近年來(lái)，血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑、血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑和Β受體阻滯劑等多種藥物應(yīng)用于臨床，取得了一定的療效，但仍無(wú)法阻止心室重構(gòu)的發(fā)生。這說(shuō)明影響MI后心室重構(gòu)的因素還有很多。國(guó)外學(xué)者初步研究發(fā)現(xiàn)，粘結(jié)蛋白聚糖1SYNDEDAN1，SDC1在心肌損傷修復(fù)過(guò)程中作為炎癥和基質(zhì)重構(gòu)的中心調(diào)節(jié)因子出現(xiàn)，在病理性心室重構(gòu)中起負(fù)性調(diào)節(jié)作用，但具體機(jī)制尚不明確。作為防治心室重構(gòu)的新靶點(diǎn)，明確SDC1在MI后體內(nèi)表達(dá)的特點(diǎn)，并探討其作用和機(jī)制具有十分重要的意義。本研究①以MI大鼠為模型，分時(shí)段定量觀(guān)察SDC1在MI大鼠體內(nèi)表達(dá)的時(shí)間分布特點(diǎn)；②構(gòu)建攜帶大鼠SDC1CDNA的重組腺病毒載體ADCMVGFPSDC1；③在體轉(zhuǎn)染ADCMVGFPSDC1，使SDC1在MI大鼠體內(nèi)過(guò)表達(dá)，觀(guān)察其對(duì)膠原合成、心室重構(gòu)和心臟功能的影響，并初步探討其可能的作用機(jī)制，旨在為MI后心室重構(gòu)的防治提供新的思路和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。第一章SDC1在MI大鼠體內(nèi)表達(dá)的時(shí)間分布特點(diǎn)11目的建立MI大鼠模型，定量觀(guān)察SDC1在MI大鼠體內(nèi)表達(dá)的時(shí)間分布特點(diǎn)。12方法121分組SD大鼠44只，結(jié)扎前降支建立MI大鼠模型。術(shù)后24H存活大鼠隨機(jī)分為MI1天組MI1D組、MI3天組MI3D組、MI7天組MI7D組和MI14天組MI14D組。另設(shè)假手術(shù)組。每組N6。122方法觀(guān)察結(jié)束時(shí)處死大鼠，檢測(cè)以下指標(biāo)1221MI大鼠模型的建立與評(píng)估指標(biāo)①M(fèi)I面積HE染色；②梗死邊緣區(qū)膠原沉積情況MASSON染色；③心臟功能超聲心動(dòng)圖和血流動(dòng)力學(xué)檢查；④心臟重量。1222SDC1在MI大鼠體內(nèi)表達(dá)的時(shí)間分布特點(diǎn)指標(biāo)檢測(cè)不同時(shí)間段梗死邊緣區(qū)SDC1MRNAREALTIMEPCR、蛋白WESTERNBLOT和血清中可溶性SDC1ELISA法表達(dá)水平。13結(jié)果131MI大鼠模型的建立與評(píng)估各組大鼠MI面積無(wú)差異P005。假手術(shù)組大鼠心肌膠原纖維少，心臟各室壁厚度正常，運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)。MI14D組大鼠梗死邊緣區(qū)膠原纖維增加，左室前壁變薄，室壁運(yùn)動(dòng)減弱或消失，心臟功能下降P001，心室重量增加P001。132SDC1在MI大鼠體內(nèi)表達(dá)的時(shí)間分布特點(diǎn)假手術(shù)組大鼠心肌SDC1MRNA和蛋白表達(dá)量低，血清中可溶性SDC1水平低。MI術(shù)后大鼠梗死邊緣區(qū)SDC1MRNA和蛋白表達(dá)逐漸增加，血清中可溶性SDC1水平逐漸升高，三者均在第3天達(dá)到高峰，此后逐漸下降，各組比較差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義P001。133PEARSON相關(guān)分析顯示MI大鼠血清中可溶性SDC1水平與梗死邊緣區(qū)心肌組織SDC1蛋白表達(dá)水平呈正相關(guān)R0952，N30，T16533，P001。14小結(jié)141采用結(jié)扎前降支法成功建立MI大鼠模型，模型的可重復(fù)性和均一性良好。142基礎(chǔ)狀態(tài)下，大鼠心肌可檢測(cè)到SDC1MRNA和蛋白表達(dá)，血清中存在可溶性SDC1，三者表達(dá)水平均較低。MI大鼠梗死邊緣區(qū)SDC1MRNA和蛋白表達(dá)明顯增加，血清中可溶性SDC1水平顯著升高，三者均在第3天達(dá)到高峰，此后逐漸下降，呈現(xiàn)動(dòng)態(tài)變化。143MI大鼠血清中可溶性SDC1水平與梗死邊緣區(qū)心肌組織SDC1蛋白表達(dá)水平呈正相關(guān)。第二章重組腺病毒載體ADCMVGFPSDC1的構(gòu)建21目的構(gòu)建攜帶大鼠SDC1CDNA的重組腺病毒載體ADCMVGFPSDC1。22方法采用基因重組技術(shù)和改良的體外連接法構(gòu)建重組腺病毒載體ADCMVGFPSDC1；在293細(xì)胞中擴(kuò)增，CSCL梯度離心純化，以基因測(cè)序、酶切及PCR法進(jìn)行鑒定，用TCID50法測(cè)定病毒的生物活性。23結(jié)果基因測(cè)序顯示質(zhì)粒PCMVSPT61SDC1正確攜帶大鼠SDC1基因。酶切結(jié)果顯示成功構(gòu)建出重組穿梭質(zhì)粒和重組腺病毒質(zhì)粒。PCR證實(shí)重組腺病毒攜帶SDC1基因片段，提示ADCMVGFPSDC1構(gòu)建成功。TCID50法測(cè)得重組腺病毒生物活性為21011PFUML。24小結(jié)采用基因重組技術(shù)和改良的體外連接法成功構(gòu)建出攜帶大鼠SDC1基因的重組腺病毒載體ADCMVGFPSDC1，經(jīng)擴(kuò)增和純化，獲得重組腺病毒生物活性為21011PFUML。第三章SDC1過(guò)表達(dá)對(duì)MI大鼠心室重構(gòu)的影響及機(jī)制探討31目的在體轉(zhuǎn)染ADCMVGFPSDC1，觀(guān)察SDC1過(guò)表達(dá)對(duì)MI大鼠心室重構(gòu)和心臟功能的影響并探討其可能的作用機(jī)制。32方法321分組SD大鼠48只，結(jié)扎前降支術(shù)后即刻，在梗死邊緣區(qū)行心肌內(nèi)注射。根據(jù)注射內(nèi)容物的不同分組①M(fèi)IADCMVGFPSDC1轉(zhuǎn)染組N8，注射ADCMVGFPSDC1；②MIADGFP對(duì)照組N8，注射ADGFP；③MI鹽水組N8，注射生理鹽水；④假手術(shù)組N6。322方法重組腺病毒轉(zhuǎn)染術(shù)后14天處死大鼠，檢測(cè)以下指標(biāo)3221重組腺病毒轉(zhuǎn)染與鑒定的指標(biāo)①注射點(diǎn)腺病毒的表達(dá)觀(guān)察綠色熒光；②梗死邊緣區(qū)SDC1MRNAREALTIMEPCR、蛋白WESTERNBLOT和血清中可溶性SDC1ELISA法表達(dá)水平。3222SDC1過(guò)表達(dá)對(duì)MI大鼠心室重構(gòu)影響的指標(biāo)①Ⅰ型、Ⅲ型膠原表達(dá)比例天狼星紅染色和排列情況透射電鏡；②Ⅰ型、Ⅲ型膠原MRNA水平REALTIMEPCR法；③MI面積、CVF、羥脯氨酸含量、膠原含量和心臟重量。3223SDC1過(guò)表達(dá)對(duì)MI大鼠心臟功能影響的指標(biāo)超聲心動(dòng)圖和血流動(dòng)力學(xué)檢查。3224SDC1作用機(jī)制探討的指標(biāo)①對(duì)炎癥的影響HE染色；②對(duì)心肌細(xì)胞凋亡的影響TUNEL法；③P38MAPKMRNAREALTIMEPCR和蛋白WESTERNBLOT法表達(dá)水平。34小結(jié)341采用心肌內(nèi)注射法成功在體轉(zhuǎn)染重組腺病毒，使SDC1在轉(zhuǎn)染后的MI大鼠體內(nèi)過(guò)表達(dá)。342MI大鼠心室重量和膠原含量增加，心功能下降，存在心室重構(gòu)。SDC1過(guò)表達(dá)能減輕心室重量，減少膠原合成，改善心室重構(gòu)和心臟功能，提示SDC1可能在MI后心室重構(gòu)中具有重要作用。343MI大鼠梗死邊緣區(qū)有大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，心肌細(xì)胞大量凋亡；SDC1過(guò)表達(dá)能減少炎癥細(xì)胞和凋亡細(xì)胞，提示SDC1可能通過(guò)影響炎癥反應(yīng)和心肌細(xì)胞凋亡參與MI后心室重構(gòu)。344MI大鼠梗死邊緣區(qū)P38MAPK信號(hào)傳導(dǎo)通路明顯活化，SDC1過(guò)表達(dá)能抑制P38MAPK信號(hào)傳導(dǎo)通路活性，提示SDC1可能通過(guò)P38MAPK信號(hào)傳導(dǎo)通路起作用，但具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。全文結(jié)論41MI大鼠梗死邊緣區(qū)SDC1MRNA和蛋白表達(dá)增加，血清中可溶性SDC1水平升高，三者均在第3天達(dá)到高峰，此后逐漸下降，呈現(xiàn)動(dòng)態(tài)變化。MI大鼠血清中可溶性SDC1水平與梗死邊緣區(qū)心肌組織SDC1蛋白表達(dá)水平呈正相關(guān)。42采用基因重組技術(shù)和改良的體外連接法，成功構(gòu)建出攜帶大鼠SDC1基因的重組腺病毒載體。43采用心肌內(nèi)注射法成功在體轉(zhuǎn)染重組腺病毒，使SDC1在轉(zhuǎn)染后的MI大鼠體內(nèi)過(guò)表達(dá)。44SDC1過(guò)表達(dá)能抑制MI大鼠梗死邊緣區(qū)膠原合成，改善心室重構(gòu)和心臟功能，提示SDC1可能在MI后心室重構(gòu)中具有重要作用。45SDC1過(guò)表達(dá)能抑制MI大鼠梗死邊緣區(qū)炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡，提示SDC1可能通過(guò)影響炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡參與MI后心室重構(gòu)。46SDC1過(guò)表達(dá)能抑制MI大鼠梗死邊緣區(qū)P38MAPK信號(hào)傳導(dǎo)通路的活性，提示SDC1可能通過(guò)P38MAPK信號(hào)傳導(dǎo)通路起作用，但具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

簡(jiǎn)介：目的觀(guān)察黃芪注射液對(duì)慢性腦缺血患者認(rèn)知功能障礙的影響，并進(jìn)行該藥的安全性評(píng)價(jià)，為進(jìn)一步拓展黃芪注射液的臨床應(yīng)用提供研究依據(jù)方法200506200609在廣西中醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院老年病科住院或門(mén)診。根據(jù)時(shí)間順序收集符合納入標(biāo)準(zhǔn)的慢性腦缺血合并認(rèn)知功能障礙患者86例，按隨機(jī)分組表入組，觀(guān)察組43例，對(duì)照組43例。兩組于入院后均按西醫(yī)治療原則，采用常規(guī)治療方法，予對(duì)癥治療，同時(shí)給予口服尼莫地平片40MG，3次天。在上述基礎(chǔ)上，觀(guān)察組予黃芪注射液廣西中醫(yī)學(xué)院一附院制劑室提供（含生藥500GL），批號(hào)桂衛(wèi)藥制字1998005090100ML靜脈點(diǎn)滴，1次天，每療程30D，連用2個(gè)療程。認(rèn)知功能障礙療效評(píng)估采用簡(jiǎn)易智力狀況檢查量表MMSE及長(zhǎng)谷川癡呆量表（HDS），腦血流評(píng)估采用經(jīng)顱多普勒TCD檢查分析，血液流變學(xué)檢查采用重慶維多公司F03010B全自動(dòng)血液流變儀（壓力法）測(cè)定，并進(jìn)行用藥前后肝、腎功能、血、尿常規(guī)測(cè)定。結(jié)果86例患者全部進(jìn)入結(jié)果分析。1、一般資料顯示年齡、性別、病程、體重指數(shù)、病情程度和合并癥等在治療前兩組比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義P＞005。2、治療后觀(guān)察組簡(jiǎn)易智力狀況檢查量表和長(zhǎng)谷川癡呆量表積分較治療前及治療后對(duì)照組顯著提高（P＜001或P＜005）兩組簡(jiǎn)易智力狀況檢查量表和長(zhǎng)谷川癡呆量表積分治療前后差值均數(shù)比較差異有顯著性P＜001。3、認(rèn)知功能療效評(píng)定，觀(guān)察組總有效率高于對(duì)照組100％，7907％，P＜001。4、經(jīng)顱多普勒檢查和血液流變學(xué)各項(xiàng)指標(biāo)檢測(cè)觀(guān)察組均優(yōu)于對(duì)照組（P＜001或P＜005）。5、治療前后86例患者的肝、腎功能、血、尿常規(guī)均無(wú)異常改變，治療過(guò)程中亦未出現(xiàn)明顯不良反應(yīng)。結(jié)論黃芪注射液具有顯著改善慢性腦缺血患者認(rèn)知功能、提高臨床療效，并具有改善腦血流和血液流變學(xué)等作用。提示黃芪注射液對(duì)慢性腦缺血患者具有較好的臨床治療效果且安全性良好。

簡(jiǎn)介：中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué)（北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院）博士學(xué)位論文腺相關(guān)病毒介導(dǎo)Β淀粉樣肽單鏈抗體基因治療阿爾茨海默病的研究姓名劉飛申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別博士專(zhuān)業(yè)臨床醫(yī)學(xué)指導(dǎo)教師王世真李方20070601第二部分PSNAV20EGFP轉(zhuǎn)染小鼠肺癌LA795穩(wěn)定細(xì)胞系的建立。經(jīng)磷酸鈣共沉淀法將PSNAV20EGFP轉(zhuǎn)入LA795細(xì)胞，2天后加入6001AG／RTL的G418抗生素篩選，抑制沒(méi)有轉(zhuǎn)入或者沒(méi)有穩(wěn)定轉(zhuǎn)入外源基因的細(xì)胞生長(zhǎng)，經(jīng)過(guò)2周的篩選后，僅剩下穩(wěn)定轉(zhuǎn)染表達(dá)EGFP的細(xì)胞，通過(guò)有限稀釋法，將這些細(xì)胞盡量以單細(xì)胞分入96孔板繼續(xù)培養(yǎng)，并加入3001AG／GL的G418維持濃度。當(dāng)細(xì)胞分裂增長(zhǎng)呈克隆后，再轉(zhuǎn)入48孔板繼續(xù)培養(yǎng)，繼而轉(zhuǎn)入24孔板，6孔板，最后得到穩(wěn)定轉(zhuǎn)染PSNAV20EGFP的小鼠肺癌LA795細(xì)胞系；結(jié)論經(jīng)過(guò)磷酸鈣共沉淀法聯(lián)合G418抗生素的篩選，可以得到穩(wěn)定表達(dá)外源基因的細(xì)胞系，該株細(xì)胞可作為包裝細(xì)胞系，用于重組腺相關(guān)病毒的包裝。第三部分AAV20EGFP和AAV20VEGFIRESEGFP的包裝和純化。以RAAVHELPERFREESYSTEM為生產(chǎn)平臺(tái)，以STRATEGENE公司的PHELPER和PAAVRC為輔助質(zhì)粒，聯(lián)合PSNAV20EGFP，采用磷酸鈣法三質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染的技術(shù)將三個(gè)質(zhì)粒轉(zhuǎn)入HEK293T細(xì)胞中，3天后搜集純化病毒，測(cè)定病毒生物滴度。結(jié)論以STRATEGENE公司的PHELPER和PAAVRC為輔助質(zhì)粒，加上本元正陽(yáng)公司的載體質(zhì)粒PSNAV20EGFP，利用三質(zhì)粒共轉(zhuǎn)的方法可以成功包裝出有生物活性的重組腺相關(guān)病毒顆粒，經(jīng)過(guò)初步純化后可用于細(xì)胞試驗(yàn)。第四部分AAV20一A13SCFV的包裝和純化。PHELPER、PAAVRC、PSNAV20A13SCFV共同轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞中，三天后搜集病毒，并初步純化，將搜集到的病毒轉(zhuǎn)染HELA細(xì)胞，WESTERN法測(cè)定單鏈抗體

簡(jiǎn)介：目的通過(guò)對(duì)華北制藥集團(tuán)新藥研究開(kāi)發(fā)有限責(zé)任公司生產(chǎn)的HUMABSNM57在大鼠和獼猴體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)研究，為HUMABSNM57的藥代動(dòng)力學(xué)特點(diǎn)提供客觀(guān)準(zhǔn)確的評(píng)價(jià)，為其臨床研究給藥方案的設(shè)計(jì)和優(yōu)化提供有力的理論依據(jù)。方法放射性同位素Ⅰ標(biāo)記法結(jié)合TCA沉淀法以及凝膠高效液相色譜法SHPLC研究HUMABSNM57在大鼠體內(nèi)的吸收、分布、代謝和排泄過(guò)程。間接ELISA法測(cè)定獼猴血清樣品中HUMABSNM57的濃度，研究HUMABSNM57在獼猴體內(nèi)的代謝過(guò)程。結(jié)果和結(jié)論獼猴IM20IUML、60IUML和120IUMLHUMABSNM57后，吸收較慢，血清藥物濃度分別于920±541H、840±433H、800±277H達(dá)峰，峰濃度分別為2176±672NGML、8124±1246NGML和17838±3567NGML，隨后開(kāi)始一個(gè)較慢的消除過(guò)程，三個(gè)劑量組的血清藥物濃度均可檢測(cè)至552H，到552H基本降至本底。低、中、高劑量組給藥劑量之比為136，藥物峰濃度之比為13782，AUC之比為15097，基本與給藥劑量成正相關(guān)，提示該藥的線(xiàn)性藥代動(dòng)力學(xué)特性。低、中、高劑量組之間部分時(shí)間點(diǎn)的血清藥物濃度差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。獼猴IV20IUMLHUMABSNM57后，5MIN血藥濃度為8229±1159NGML，隨后逐漸降低，到552H基本降到本底水平。與IM等劑量HUMABSNM57相比，在120H前IV血藥濃度高于IM，120H后IM高于IV，408H以后趨于相似。IV和IM組相同時(shí)間點(diǎn)配對(duì)T檢驗(yàn)有少數(shù)時(shí)間點(diǎn)差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。獼猴IM20IUMLHUMABSNM57的絕對(duì)生物利用度是726％±337％，但獼猴個(gè)體之間差異較大。獼猴L(fēng)M20IUMLHUMABSNM57的同時(shí)在第0、3、7、14天IM狂犬疫苗，與獼猴單獨(dú)IV20IUKGHUMABSNM57組相同時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行配對(duì)T檢驗(yàn)，240H前差別沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，240H后差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，肌注狂犬疫苗組的抗狂犬病毒抗體在408H后激增，符合狂犬病毒疫苗的作用原理。SD大鼠IMIHUMABSNM57后，吸收較慢，達(dá)峰時(shí)間T平均為440±145H；總放射性和酸沉放射性峰濃度分別為4982±369NGML和4936±372NGML；AUC分別為776±169ΜGHML和756±168ΜGHML；MRT分別為1027±182H和1005±184H；清除率CL分別為13±02MLHKG和13±02MLHKG；VSS分別為1307±63MLKG和1322±64MLKG；末端消除相半衰期T分別為1150±351H和986±300H?？偡派湫院蚑CA沉淀放射性的絕對(duì)生物利用度分別為813±44％和792±83％，生物利用率比較高。HUMABSNM57在小鼠體內(nèi)廣泛分布，無(wú)明確的靶向性，排泄主要途徑是尿液排泄。藥物的血漿蛋白結(jié)合試驗(yàn)表明IHUMABSNM57不與大鼠的血漿蛋白結(jié)合。