基于殼聚糖類的組氨酸標簽蛋白純化介質的制備及應用.pdf

1、蛋白質不僅是生命活動的物質基礎，而且也是生物體內的功能性大分子。隨著生物技術的發(fā)展，人們通過基因重組技術利用微生物大量表達功能性蛋白，比如可食性功能蛋白，藥物蛋白等，而這些蛋白質的分離純化是蛋白質組學和蛋白質功能性研究的前提和基礎，并且增加蛋白樣品的純度和保持樣品的活性是各種蛋白質分離純化的共同目的，因此研究開發(fā)新穎的蛋白純化介質是一熱點。
　　殼聚糖是地球上僅次于纖維素的第二大可再生資源，是一種天然無毒的N-乙酰氨基葡萄糖組成的

2、長鏈多糖，因其較好的生物相容性和化學穩(wěn)定性，近年來逐漸在HIC(疏水相互作用色譜)上得到廣泛應用。本課題有機結合殼聚糖的特性和IMAC(固定化金屬離子親和色譜)技術，在殼聚糖長鏈中通過有機合成手段引入螯合金屬離子強的配體乙二胺四乙酸(EDTA)，并螯合過渡金屬，用于組氨酸標簽蛋白的分離純化。進一步對純化介質的重復利用能力和回收再生方法進行探究，旨在開發(fā)新的經濟、快速、簡便、環(huán)保的蛋白純化介質。主要研究結果如下:
　　(1)以殼聚糖

3、為原料，制備得到EDTA-殼聚糖;利用SEM(掃描電鏡)，TEM(透射電鏡)，F(xiàn)T-IR(傅里葉變換紅外光譜)，TGA(熱重分析)等對其進行表征和分析;考察了過渡金屬離子(Ni2+、Cu2+、Zn2+)與EDTA-殼聚糖在不同吸附時間、pH、初始濃度等因素下的金屬離子螯合情況，并用ICP-MS(電感耦合等離子體質譜)測定金屬離子的結合量，結果表明:EDTA基團很好的枝接到了殼聚糖主體上，而且在吸附時間為3小時，pH值為4.0，初始濃度為

4、1.6mg/mL時，EDTA-殼聚糖對三種金屬離子的吸附達到最大值;
　　(2)以組氨酸標簽增強型綠色熒光蛋白EGFP-(His)6-NH2為研究對象來探究M2+-EDTA-殼聚糖與M2+-殼聚糖(M=Ni、Cu、Zn)對組氨酸標簽增強型綠色熒光蛋白(EGFP-(His)6-NH2)的親和性能，同時探究了孵育時間、離子強度、緩沖液pH、咪唑洗脫濃度對目標蛋白親和吸附及純度的影響。結果表明:蛋白與介質在40min內就可以達到吸附平衡

5、，pH和離子強度可以改變溶液中靜電強度和疏水相互作用來影響蛋白與介質的結合，使得不同條件下M2+-EDTA-殼聚糖(M=Ni，Cu，Zn)對蛋白親和量各有不同，同時在很大程度上影響了目的蛋白純度;
　　(3)考察此純化體系對E.coli表達的EGFP-(His)6-NH2和Kana-(His)6-NH2的分離純化。結果表明:當緩沖液pH為7.2，離子強度為500 mmol/L NaCl，洗脫緩沖液含500 mmol/L咪唑，得到純

6、度約為95％EGFP-(His)6-NH2目標蛋白;當緩沖液pH為6.2，離子強度為500mmol/L NaCl，洗脫緩沖液含200 mmol/L咪唑，得到純度約為90％的Kana-(His)6-NH2目標蛋白;
　　(4)研究了純化介質的重復利用能力和再生方法。結果表明:①M2+-EDTA-殼聚糖(M=Ni，Cu，Zn)表現(xiàn)出突出的重復利用性能，在前5次的重復利用中，對蛋白的結合率僅僅表現(xiàn)出了微量的下降，分別下降了3.9％(Ni