血友病患者的基因診斷及發(fā)病機(jī)制的研究.pdf

1、第一部分重型血友病甲患者的基因診斷及發(fā)病機(jī)制研究
　　【目的】
　　血友病甲（Hemophilia A,HA）為一種X染色體連鎖的隱性遺傳性出血性疾病，在男性人群中發(fā)病率為1/5000，女性患者極為罕見?；颊咦杂卓捎蟹磸?fù)的關(guān)節(jié)出血，嚴(yán)重者可發(fā)生腦出血危及生命。根據(jù)血漿中凝血因子VIII活性（FVIII:C）的不同將其分為輕、中、重三型。目前針對本病的治療主要依賴濃縮凝血因子VIII替代治療，尤其對于重型血友病患者來說，治療費

2、用大，生活質(zhì)量差，所以對血友病患者家系及時進(jìn)行基因檢測，及早的發(fā)現(xiàn)攜帶者，可以有效的減少血友病患兒的誕生。
　　【方法】
　　對2009年至2014年期間在蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院血友病中心就診的43例重型血友病甲男性患者進(jìn)行FVIII基因突變的檢測，其中用長距離PCR法檢測22號內(nèi)含子倒位，雙管PCR法檢測1號內(nèi)含子倒位，以及FVIII基因26個外顯子及其側(cè)翼序列的直接測序并將測序結(jié)果和 NCBI基因庫（genebank）所公

3、布的FVIII（NM.000132.3）基因序列進(jìn)比對，尋找基因突變，并排除多態(tài)性。
　　【結(jié)果】
　　43例患者中，21例患者發(fā)現(xiàn)22號內(nèi)含子倒位(占48.8％)，1號內(nèi)含子突變未發(fā)現(xiàn)。余下22例患者均發(fā)現(xiàn)基因突變位點，共有21種突變，其中點突變13例，小片段缺失7例（其中2例為同種突變），小片段插入2例；其中導(dǎo)致氨基酸錯義突變5例，無義突變6例，移碼突變9例，剪接位點突變2例。其中7種基因突變國際上未見報到，為首次發(fā)現(xiàn)。

4、分別為：c.214G>T（E72X），c.215T>C（F73S），IVS5+2G＞A（splicing)，c.2519C>G(S840X)，c.3180delA（V1061Xfs），c.5639delA（N1880Tfs*3），c.6572delA（N2191Mfs*18）。
　　【結(jié)論】
　　43例HA患者的基因分析表明FVIII基因突變具有明顯的異質(zhì)性，22號內(nèi)含子倒位是重型血友病A患者的主要突變方式。通過分析7例新的

5、突變的發(fā)病機(jī)制，對血友病A發(fā)病機(jī)制的的進(jìn)一步研究提供了基礎(chǔ)，血友病甲攜帶者及孕婦進(jìn)行快速、準(zhǔn)確的診斷打下了基礎(chǔ)。
　　第二部分重型血友病A患者凝血因子VIII抑制物檢測及其產(chǎn)生影響因素的分析
　　【研究目的】
　　血友病甲（Hemophilia A, HA）是由于凝血因子VIII（FVIII）基因缺陷，導(dǎo)致的血漿FVIII質(zhì)或量的異常而引起的一種X染色體連鎖的隱形遺傳性出血性疾病。目前本病主要治療方法為FVIII制劑的

6、替代治療，而FVIII抑制物是血友病A患者反復(fù)輸注FVIII制劑后產(chǎn)生的一種同種抗體，有中和并完全滅活FVIII活性的作用，是血友病A患者發(fā)生的最嚴(yán)重的并發(fā)癥。近年來隨著血友病替代治療的不斷推廣，重型HA患者接受替代治療的強度較以往大大增加，因此抑制物的防治也越來越得到重視，在本研究中我們對2004年至2014年期間在我院確診的重型血友病患者進(jìn)行抑制物產(chǎn)生影響因素的分析，旨在指導(dǎo)臨床上重型血友病A患者的治療。
　　【方法】

7、　　收集2009年至2014年期間在蘇州大學(xué)附屬一院血友病中心確診的43例重型血友病甲（HA）男性患者外周血樣本，運用Nijmegen改良的Bethesda方法對43例患者進(jìn)行FVIII抑制物的檢測。進(jìn)一步分析患者抑制物的發(fā)生與首次接受替代治療的年齡、暴露日、FVIII基因突變類型因素的相關(guān)性。
　　【結(jié)果】
　　43例男性重型血友病A患者，首次接受替代治療的年齡<1歲組的14例（32.6%），1～5歲組22例（51.2%）

8、，≥5歲組7例（16.3%）。暴露日<10ED組的患者15例（34.9%），10～50ED組8例（18.6%），≥50ED組20（46.5%）例。43例患者中抑制物陽性患者9例(占20.9%)，中位抑制物滴度0.82BU（0～14BU），陰性患者34例（占79.1%）。FVIII基因突變類型中無效突變38例（88.4%），非無效突變5例（11.6%）。對43例接受過替代治療的重型血友病 A患者進(jìn)行發(fā)生抑制物的單因素及多因素分析，在觀察的

9、諸多因素中，包括首次替代治療年齡、暴露日及突變類型與患者是否出現(xiàn)抑制物差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。
　　【討論】
　　血友病患者抑制物產(chǎn)生的影響因素眾多，如何能夠有效的減少抑制物的發(fā)生，仍然需要進(jìn)行不斷的大樣本研究。如能根據(jù)發(fā)生抑制物的危險程度，對血友病患者進(jìn)行分層治療將會更加有意義。
　　第三部分凝血因子IX酶催化區(qū)突變致女性血友病乙一例試驗研究
　　【研究目的】
　　血友病乙（Hemophili

10、a B, HB）是一種 X連鎖隱性遺傳性出血性疾病，多為男性發(fā)病，女性血友病乙患者罕見，本研究對一例女性血友病乙患者進(jìn)行表型和基因型分析，探討其發(fā)病機(jī)制。
　　【方法】
　　對一例女性血友病乙先證者、其父母及其女兒進(jìn)行血漿部分活化凝血酶原時間（APTT）、凝血酶原時間（PT），血漿凝血因子IX活性（FIX:C），血漿凝血因子VIII活性（FVIII:C）測定，并進(jìn)行FIX抑制物活性測定；運用PCR技術(shù)對先證者及其父母、女兒的

11、FIX基因的所有外顯子及其側(cè)翼序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng)測序分析并尋找突變位點；對先證者及其父母運用多重?zé)晒釶CR技術(shù)檢測16個STR位點進(jìn)行親子分析。用Western blot的方法檢測患者血漿中FIX蛋白含量。在HEK293細(xì)胞中分別轉(zhuǎn)染野生型質(zhì)粒、突變型質(zhì)粒以及突變型/野生型雙質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染，繼而使用Western blot的方法檢測細(xì)胞上清液及裂解液的FIX蛋白含量。通過PCR聯(lián)合甲基化敏感的限制性內(nèi)切酶HhaI酶切PCR產(chǎn)物的方法

12、檢測ZNF261基因上的甲基化位點，檢測患者是否存在X染色體非隨機(jī)失活。
　　【結(jié)果】
　　先證者因頭部外傷后顱內(nèi)血腫入院，既往有產(chǎn)后出血過多及術(shù)后出血難止病史。父母非近親結(jié)婚，均無出血病史。先證者血漿APTT62.2s，PT13.9s，F(xiàn)IX:C2%，F(xiàn)VIII:C148%，F(xiàn)IX抑制物陰性；患者父母、女兒血漿APTT、PT、FIX:C、FVIII:C均正常。FIX基因分析發(fā)現(xiàn)，先證者FIX基因的8號外顯子存在T1108G

13、（Phe314Cys）雜合突變，已排除基因多態(tài)性，且此突變國際上尚無報道；患者父母及女兒FIX基因測序結(jié)果均正常。STR分析證實先證者與其父母為親子關(guān)系?；颊哐獫{中存在FIX蛋白，與正常人相比無明顯差別。體外表達(dá)實驗發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染野生型F9WT質(zhì)粒的細(xì)胞與轉(zhuǎn)染F9MT(Phe314Cys)質(zhì)粒的細(xì)胞以及F9WT/F9MT雙質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，進(jìn)行比較，表達(dá)上清中及細(xì)胞裂解液中FIX蛋白的含量無明顯差別。X染色體非隨機(jī)失活實驗證實患者來源于母親

14、的X染色體發(fā)生了甲基化不能被酶切，而來源于父親的X染色體被完全酶切。
　　【討論】
　　血友病乙為X染色體連鎖隱性遺傳性出血疾病，女性罕見，女性發(fā)病機(jī)制主要是X染色體的非隨機(jī)失活、X染色體的結(jié)構(gòu)異?；騀IX基因的純合突變所致。先證者臨床特點及表型檢測結(jié)果符合血友病乙，基因分析結(jié)果證實先證者的FIX基因8號外顯子存在T36029G（Phe314Cys）雜合突變，突變位于酶催化區(qū)域，該突變導(dǎo)致患者血漿中FIX活性下降，但并未影響