斑馬魚Clusterin基因的克隆、表達及調控研究和成肌細胞中IGFs表達調控機理的初步研究.pdf

1、(1)Clusterin是一種高度保守的、普遍存在的異源二聚體硫酸化糖蛋白,該蛋白廣泛表達于機體許多組織中,不僅與多種生物過程相關,而且與多種病理狀態(tài)有關。最近的全基因組關聯(lián)分析(Genome-wide association study,GWAS)結果表明Clusterin基因與阿茲海默病的病因學相關。然而,關于Clusterin基因的體內(nèi)功能以及其在阿茲海默病病理中的作用卻了解的很少。盡管人們利用多種哺乳動物細胞系在體外進行了大量關

2、于Clusterin可能的細胞作用研究,但是對于Clusterin蛋白的體內(nèi)生理功能還不清楚?；蚯贸鼵lusterin的小鼠發(fā)育和生存都很正常,Clusterin基因在早期發(fā)育中的功能至今還是個未解決的重要問題。
　　 在該研究中,我們克隆得到了斑馬魚的Clusterin基因,并且確定了其結構上的保守性、在發(fā)育中的表達模式及其生理調控。斑馬魚的Clusterin基因和蛋白與人的直向同源基因Clusterin相似。生化方法測定表

3、明斑馬魚Clusterin屬于分泌型蛋白,并且不能與IGFs直接結合。在成年斑馬魚的很多組織中都能檢測到Clusterin mRNA的表達。在斑馬魚早期發(fā)育中,從12hpf開始檢測到C1usterin mRNA的表達,并且其表達水平在此之后逐漸增加。整胚原位雜交分析表明Clusterin mRNA在發(fā)育中的間腦脈絡叢和中腦脈絡叢中特異性地表達。在我們檢測的各種脅迫中,熱激脅迫能夠增加Clusterin mRNA的表達水平,但是缺氧和離子

4、脅迫卻不能改變Clusterin mRNA的表達水平。在斑馬魚早期發(fā)育中,抑制IGF-1受體介導的信號通路或者過表達IGF配體都不能改變C1usterin mRNA的表達水平。與之對比,特異性地抑制或者基因敲降Notch信號通路后,Clusterin mRNA在脈絡叢中的表達水平顯著提高。這些結果表明在斑馬魚胚胎和幼體中Clusterin是脈絡叢的一個標記基因,并且其在脈絡叢中的表達受到Notch信號通路的調控但不受IGF信號通路的調控

5、。
　　 (2)類胰島素生長因子(IGF)信號系統(tǒng)是一個進化上相對保守的信號途徑,在多種脊椎動物和細胞系中的研究表明,IGF信號系統(tǒng)在調節(jié)骨骼肌的生長、分化和維持成體肌肉組織的動態(tài)平衡中起著關鍵的作用。近年來,雖然人們已經(jīng)對肌原分化中IGFs的表達和功能展開了較為深入的研究,并且研究表明IGFs具有治療肌肉相關性疾病(如肌肉萎縮、肌肉營養(yǎng)失調和神經(jīng)肌肉疾病等)的潛力,但是一直以來缺少外源性IGFs對內(nèi)源性IGFs表達調控方式及其

6、機制的研究。
　　 我們利用肌肉分化模式細胞-C2C12成肌細胞的優(yōu)勢,在該方面進行了研究。首先,我們通過向C2C12細胞中外源性地加入IGF-2蛋白,得出了外源性IGF-2以相反的方式調控內(nèi)源性IGF-1和IGF-2 mRNA表達的結論:分別降低和提高內(nèi)源性IGF-1和IGF-2 mRNA的表達水平;并且該調節(jié)方式具有時間依賴性。隨后通過insulin、IGF-1和IGF-2的劑量反應效應實驗我們推測得出IR、IGF-1R和雜