自噬介導的MCT1對人肝癌細胞能量代謝的影響及機制研究.pdf

1、目的：
　　肝癌是世界范圍內十種最常見的實體型惡性腫痛之一，其死亡率占癌癥死亡原因的第二位。目前針對肝癌的治療卻往往得不到理想的效果。因此，提高肝癌的早期診斷及治療技術是目前需要解決的重大問題。其中，尋找關鍵性分子并進行功能研究成為生物學研究的重要方向之一。在肝癌的演變過程中，伴隨有細胞能量代謝方式的改變，即從氧化磷酸化到有氧糖酵解(Warburg效應)。而有氧糖酵解的強弱主要由糖酵解關鍵酶和膜轉運蛋白調控，例如:葡萄糖轉運蛋白1

2、(GLUT1)，單羧酸轉運蛋白1(MCT1)，丙酮酸激酶M2型(PKM2)等。研究認為肝癌的迅速生長以及細胞活性與其糖酵解狀態(tài)緊密相關。由于肝癌具有快速生長增殖的特性，腫瘤微環(huán)境不能完全供給肝癌細胞生長所需能量，這導致其往往處于缺氧和低營養(yǎng)的生長環(huán)境下。目前，在低營養(yǎng)狀態(tài)下肝癌細胞是如何獲得充足的能量并維持其快速增殖這一現象的機制仍有待進一步研究。近來研究表明在缺氧、營養(yǎng)缺乏環(huán)境中，自噬對肝癌細胞是一種保護機制，自噬可以通過影響脂代謝促

3、進肝癌細胞存活并維持其增殖。那么，作為肝癌主要供能途徑的糖代謝是否也受自噬的調控呢？自噬對糖代謝的調控是通過什么方式實現的呢？本課題擬通過westernblot，PCR等技術探索在營養(yǎng)缺乏條件下自噬是否對肝癌能量代謝具有調控作用以及其具體機制為肝癌治療提供理論基礎。
　　方法：
　　1.應用western blot、免疫熒光、電子透射顯微鏡技術檢測肝癌細胞系HepG2，Bel-7402在饑餓狀態(tài)下及聯合應用自噬抑制劑3-MA

4、時的自噬水平;
　　2.應用流式細胞術研究在饑餓狀態(tài)下自噬對肝癌細胞系生物學行為的影響;
　　3.應用葡萄糖檢測試劑盒、乳酸檢測試劑盒評價在饑餓狀態(tài)下自噬對肝癌細胞能量代謝的影響;
　　4.應用real time-PCR，western blot檢測饑餓狀態(tài)下自噬對能量代謝關鍵酶及相關蛋白的影響;
　　5.應用real time-PCR，western blot檢測饑餓狀態(tài)下自噬對CAV-1表達的影響;
　

5、　6.應用EBSS培養(yǎng)細胞并轉染pcDNA3.1-CAV-1質粒，檢測MCT1表達;
　　7.免疫組化檢測肝癌及正常肝組織中LC3、MCT1表達并進行臨床病理參數分析和相關性分析;
　　結果：
　　1.應用EBSS誘導肝癌細胞系饑餓后，肝癌細胞系HepG2、Bel-7402自噬明顯增強;而聯合應用自噬抑制劑3-MA則可使其自噬水平降低;
　　2.在饑餓狀態(tài)下應用自噬抑制劑能夠導致肝癌細胞系增殖減慢并發(fā)生凋亡現象;

6、
　　3.饑餓狀態(tài)下抑制自噬后，肝癌細胞系葡萄糖消耗及乳酸產生減少;提示自噬能夠影響肝癌細胞能量代謝;
　　4.饑餓誘導自噬后，肝癌細胞MCT1表達明顯增加;而聯合應用自噬抑制劑3-MA可以減少MCT1表達;
　　5.饑餓誘導自噬后肝癌細胞系CAV-1表達降低;
　　6.饑餓狀態(tài)下，過表達CAV-1后MCT1表達降低;
　　7.LC3、MCT1在肝癌組織中呈高表達，兩者呈正相關;LC3、MCT1表達與肝癌的