超聲場影響大腸桿菌細胞膜通透性的研究.pdf

1、超聲新技術的出現(xiàn)引起了人們的濃厚興趣，已廣泛應用于生物和醫(yī)學領域，特別在對細胞膜的影響方面成為研究熱點。提高膜通透性在獲取胞內產物或使胞外大分子進入胞內方面有重要的應用意義。傳統(tǒng)用于提高細胞膜通透性的是化學法具有處理時間長、效率低、試劑用量大、成本高、后處理麻煩等缺點。本論文以基因工程上常用的大腸桿菌為研究對象，研究了不同超聲參數(shù)對細菌細胞膜通透性的影響。在此基礎上，對超聲作用參數(shù)進行優(yōu)化，選擇合理的超聲條件，確定超聲提高大腸桿菌細胞膜

2、通透性的最適工藝條件。進而與化學方法進行比較。研究中應用熒光探針法考察細胞膜通透性、膜電壓，胞內活性氧(ROS)、游離鈣(Ca2+)的變化并且利用掃描電鏡、透射電鏡觀察，從微觀角度分析超聲場提高大腸桿菌細胞膜通透性的機理。建立超聲作用大腸桿菌細胞膜變化的動力學模型。研究表明： 變幅桿浸入式超聲的功率、作用時間、間隙時間(頻率為25kHz)對大腸桿菌膜的通透性及生存率均有影響。對這三個參數(shù)進行三因素三水平正交實驗，其結果顯示，超

3、聲的電功率、作用時間對大腸桿菌生存率的影響極顯著，間隙時間對大腸桿生存率的影響不顯著；超聲波的電功率、作用時間對大腸桿菌的細胞膜通透性影響極顯著，間隙時間對大腸桿菌細胞膜通透性的影響顯著。影響大腸桿菌細胞膜通透性大小先后次序為：作用時間＞電功率＞間隙時間。優(yōu)化提高大腸桿菌細胞膜通透性的最佳作用參數(shù)為：作用電功率為300W、作用時間為90s、間隙時間為4s。 化學方法與超聲方法比較。實驗表明：化學方法可以提高細胞膜的通透性，但是

4、對細胞活性的影響很大，經過處理后的大腸桿菌的存活率很低。該方法提高細胞膜通透性時用的化學試劑消耗量大、費用高，試劑殘留造成環(huán)境污染，而且后處理過程復雜，不易實現(xiàn)生產連續(xù)化。適當超聲處理不僅可以提高細胞膜對代謝產物的通透性，使細胞仍保持一定的活性，而且操作參數(shù)易控制、目標產物易分離、無殘余毒性、與環(huán)境友好、高效、價廉、無污染、適用性強、易于實現(xiàn)自動化、連續(xù)化、具有極大的應用潛力，顯示出超聲方法的優(yōu)越性。 利用熒光探針FDA檢測來

5、反映細胞膜通透性的變化。FDA負載入大腸桿菌后發(fā)出黃綠色熒光，說明利用FDA熒光探針染色法標記可行。結果顯示：在25kHz、300W、90s內，熒光強度漸漸降低，90s時下降到66.7﹪，即細胞膜通透性增加33.3﹪，此時細胞生存率為79.4﹪，再隨作用時間延長，F(xiàn)DA明顯下降，是由于細胞生存率明顯下降引起。 利用熒光探針DiBAC4(3)檢測來反映細胞膜電壓的變化。DiBAC4(3)載入大腸桿菌后發(fā)出亮綠熒光，利用DiBAC

6、4(3)熒光探針染色法標記可行。結果顯示：在25kHz、300W、30s-90s內熒光強度逐漸下降，90s時降為73.2﹪，即膜電壓下降26.8﹪，隨著時間的延長DiBAC4(3)明顯降低。在90s時細胞的存活率為79.4﹪。超聲作用90s內后膜電壓下降，胞內外離子濃度差加大，促進了分子交換速度。超聲波場引起的細胞膜電壓比較大，使得Ca2+內流量較大時，K+大量外流占優(yōu)勢，結果導致細胞膜電壓進一步超極化，膜電壓探針熒光下降。導致膜電壓依

7、賴的Ca2+、Na+以及大分子物質離子通道都打開，膜兩側離子交流加速，即膜的通透性增加。 利用熒光探針DCFH-DA法檢測來反映胞內活性氧的變化。大腸桿菌經DCFH-DA負載發(fā)出綠色熒光，DCFH-DA熒光探針染色法標記可行。結果顯示：經25kHz、300W，30-90S超聲作用后DCFH-DA增加，說明一定超聲作用后大腸桿菌細胞內活性氧水平提高。在超聲作用的空化效應特別易產生活性氧(包括自由基)，使脂雙分子層過氧化而有破壞膜

8、結構。膜變脆易穿孔，流動性也變差。ROS水平上升導致ROS依賴性的鈣離子通道打開，進而鈣離子依賴性的其它(K+，Na+等)通道也打開，膜兩側物質交流加速，即膜通透性增加。 利用熒光探針Fura-2/AM法檢測來反映胞內鈣離子的變化。大腸桿菌經Fura-2/AM負載后發(fā)出亮藍色熒光，F(xiàn)ura-2/AM熒光探針染色法標記可行。結果顯示：經25kHz、300W，30-60S超聲作用后Fura-2/AM熒光強度增加，說明一定超聲作用后

9、大腸桿菌經胞內鈣離子水平提高。ROS水平增加，在信號傳導中可導致鈣高子通道打開，離子內流，胞內鈣濃度增加，實驗證實胞內鈣離子濃度是增加了，即膜通透性增加。 掃描電鏡、透射電鏡觀察顯示：未經超聲處理的細胞結構完整，細胞核、表面光滑，細胞膜清晰，膜沒有變化，沒有損傷。經25kHz、300W、30s超聲處理后細胞形態(tài)特征表現(xiàn)為細胞結構完整，細胞膜形態(tài)開始改變，細胞內部結構完整。經25kHz、300W、60s超聲處理后細胞膜完整脂雙分

10、子層開始變模糊，經25kHz、300W、90s顯示表面有小孔的地方，內容物向外滲透。經300W、150s細胞膜受嚴重，細胞質外滲，細胞開始自溶。經25kHz、300W、270s顯示隨超聲處理時間的延長細胞核破裂，細胞膜破壞，細胞變成碎片。在一定超聲作用下大腸桿菌膜通透性改變和膜穿孔。超聲空化產生自由基使膜脂過氧化，因而對細胞膜產生破壞作用，使膜結構破壞、崩解而影響其通透性。超聲作后細胞膜的電特性(電壓、電導和膜電容等)、機械特性(膜的損

11、傷或修復等)和分子運輸能力(透過膜的微粒數(shù)量等)產生變化，使細胞膜穿孔而影響其通透性。 運用傳遞理論以及質量守恒原理，建立了超聲作用大腸桿菌膜變化的動力學模型：E(t)=k3T-k1/k2+k3·e-(k2+k3)·t+k2T-k1/k2+k3 通過與實驗結果模擬表明，該模型對膜變化過程具有很好的預測功能，能反映膜變化的實際過程。 超聲在溶液中產生空化現(xiàn)象，超聲作用主要歸結于超聲的空化效應和機械效應。促進溶

12、質的擴散，提高了傳質系數(shù)，增大了傳質界面積，傳質推動力變大，從而在整體上對細胞膜通透性有增加效應。 實驗檢測與詳細的理論探討表明：超聲可提高細胞膜通透性，主動力是超聲的空化效應及機械效應。電鏡觀察膜變化過程有脂雙分子層變形效應、有‘穿孔’效應。利用所建立的擬合方程推算出超聲作用提高膜的傳質速率常數(shù)，進一步證實超聲提高膜通透性的機理。 本論文將新興的超聲技術應用于生物醫(yī)學領域，對超聲影響大腸桿菌細胞膜通透性的因素、作用