人工體神經-內臟神經反射弧手術修復神經源性膀胱尿路上皮滲透性屏障的可行性研究.pdf

1、第一部分神經源性膀胱模型制作及人工體神經-內臟神反射弧手術后再生神經形態(tài)學研究
　　目的:觀察人工體神經-內臟神反射弧手術后再生神經纖維的形態(tài)學特點和膀胱輸尿管形態(tài)。
　　方法:清潔級雌性SD大鼠60只(120~160)隨機分為三組:端端吻合組(n=20),在腰4水平切斷兩側L4VR、L6VR和S1VR神經,將L6VR與L4VR行端端吻合。損傷未吻合組(n=20),切斷兩側L6VR和S1VR神經,不進行神經端端吻合術。對照組

2、(n=20),切斷兩側S1VR神經。手術16周后,沿大鼠背側原切口找到L4VR-L6VR神經端端吻合口,在體視顯微鏡下取下距吻合口10-20mm處取10mm長再生L6神經段行1μm半薄切片甲苯胺藍染色后統(tǒng)計再生神經纖維數量及電鏡觀察超微結構形態(tài);肉眼觀察三組大鼠膀胱形態(tài)并測量膀胱殘余尿量,在體視顯微鏡下觀察三組大鼠輸尿管形態(tài)。
　　結果:超微病理顯示在端端吻合組再生L6神經前根可見大量的有髓神經纖維和雪旺氏細胞;半薄切片甲苯胺藍染

3、色顯示再生L6VR中有髓神經纖維平均數量為700.4±50.7。肉眼觀察可見端端吻合組大鼠膀胱形態(tài)正常殘余尿0.7±0.9ml,輸尿管無擴張,而未吻合組大鼠可見膀胱增大,殘余尿可達14.2±5.6ml,輸尿管明顯擴張;對照組大鼠膀胱形態(tài)正常有少許殘余尿平均約為0.3±0.2ml無輸尿管擴張。
　　結論:我們成功構建了神經源性膀胱和人工體神經-內臟神反射弧手術大鼠模型,L4VR和L6VR行端端吻合后L4VR運動神經元軸突可以長入L6

4、VR,再生的L6VR可見大量的再生有髓神經纖維和雪旺氏細胞。
　　第二部分人工體神經-內臟神反射弧手術重建膀胱神經支配的逆行神經追蹤和膀胱測壓研究
　　目的:應用逆行神經追蹤技術研究人工體神經-內臟神經反射弧手術后的神經再生并利用膀胱測壓技術研究膀胱能否重新獲得有功能的神經支配。
　　方法:清潔級雌性SD大鼠60只(120~160g)隨機分為三組:端端吻合組(n=20),切斷兩側L4VR、L6VR和S1VR神經,將L6

5、VR與L4VR行端端吻合。損傷未吻合組(n=20),切斷兩側L6VR和S1VR神經,不進行神經端端吻合術。對照組(n=20),切斷兩側S1VR神經。手術16周后,取端端吻合組、損傷未吻合組和對照組各10只,將熒光金(Fluorogold,FG)1μl注射至兩側盆神經節(jié),大鼠存活7天后4％多聚甲醛灌注固定,取L4、L6和S1脊髓節(jié)段行冰凍切片并在熒光顯微鏡下觀察被熒光標記的神經元。另取端端吻合組、損傷組及對照組各10只分別手術顯露L4VR

6、-L6VR吻合口、L6VR殘端及正常L6后將自制膀胱測壓管置于三組大鼠膀胱內分別連接微量灌注泵和BL-410生物機能采集系統(tǒng),電刺激已游離的神經后測量膀胱壓力。
　　結果:逆行追蹤結果顯示在端端吻合組L4脊髓節(jié)段切片兩側可見大量FG標記神經元,在L6和S1脊髓節(jié)段中均未見FG標記神經元;在損傷未吻合組中L4、L6和S1脊髓節(jié)段中均未見FG標記神經元;在對照組中在L6脊髓節(jié)段中可見少量雙側FG標記神經元,在L4及S1脊髓節(jié)段中均未見

7、FG標記神經元。膀胱測壓結果顯示:端端吻合組電刺激供體神經L4VR可以觀察到膀胱壓力先迅速升高到峰值,然后伴隨著尿液排出,壓力快速下降到基線水平,與對照組相類似;而刺激L6VR可見膀胱壓力隨著持續(xù)的膀胱灌注緩慢升高并保持在基線水平,而無明顯的波幅形成
　　結論:人工體神經-內臟神反射弧手術后L4VR可再生長入L6VR并重新支配盆神經節(jié)并且膀胱可獲得有功能的神經支配。
　　第三部分神經源性膀胱行人工體神經—內臟神經反射弧手術后

8、膀胱尿路滲透性屏障的功能研究
　　目的:本實驗利用普通HE染色、免疫熒光、電鏡及實時熒光定量PCR研究大鼠膀胱尿路上皮滲透性屏障功能
　　方法:清潔級雌性SD大鼠60只(120~160g)隨機分為三組:A端端吻合組(n=20),切斷兩側L4、L6和S1神經前根,將L6VR與L4VR行端端吻合。B損傷未吻合組(n=20),切斷兩側L6和S1神經前根,不進行神經端端吻合術。C對照組(n=20),切斷兩側S1神經前根。手術16周后

9、,取膀胱分別行普通HE染色;uroplakinⅢ、AQP3、ZO-1免疫熒光染色,尿路上皮電鏡研究及實時熒光定量PCR檢測膀胱炎癥因子TNF-α、IL-6和IL-1β的變化。
　　結果:HE染色顯示端端吻合組和對照組大鼠膀胱尿路上皮結構層次清晰,未吻合組大鼠膀胱尿路上皮普遍存在死亡傘細胞。免疫熒光染色顯示三組中ZO-1表達沒有顯著性差異,在端端吻合組和對照組大鼠膀胱尿路上皮AQP-3主要表達于尿路上皮基底膜,而在未吻合組中AQP3

10、表達于尿路上皮全層,uroplakinⅢ染色中顯示尿路上皮傘細胞層被破壞。尿路上皮電鏡研究顯示:端端吻合組和對照組大鼠膀胱尿路上皮中沒有中性粒細胞浸潤,緊密聯(lián)結結構清晰,傘細胞頂壁含有大量梭狀囊泡,而未吻合組大鼠膀胱尿路上皮中出現中性粒細胞浸潤,緊密聯(lián)結結構模糊,含有大圓盤狀囊泡。實時熒光定量PCR結果顯示未吻合組大鼠膀胱中炎癥因子TNF-α、IL-6和IL-1β的表達明顯高于端端吻合組和對照組,差異具有統(tǒng)計學意義。
　　結論:人