蘋果BTB-TAZ蛋白MdBTs調(diào)控MdbHLH104影響PM H+-ATP酶的活性和鐵的動態(tài)平衡.pdf

1、鐵是果樹生長和發(fā)育過程重要的微量元素，是影響果實產(chǎn)量和品質(zhì)的重要因素之一。影響鐵離子吸收的環(huán)境因素很多，如pH、營養(yǎng)元素、激素等。其中pH是影響果樹吸收鐵離子的重要因素。為了維持果樹體內(nèi)鐵離子的動態(tài)平衡，果樹根系通過質(zhì)膜H+-ATPase酶外泌質(zhì)子使得根系周圍酸化，將難溶態(tài)鐵轉(zhuǎn)化為可溶態(tài)，供根系直接吸收。質(zhì)膜H+-ATPase酶除了外泌質(zhì)子和產(chǎn)生跨膜電勢梯度外，還能為離子的轉(zhuǎn)運提供能量。因此，質(zhì)膜型(PM) H+-ATPase酶在鐵離子

2、的吸收和動態(tài)平衡過程中起著重要的作用。植物缺鐵響應(yīng)的分子機理在模式植物中已經(jīng)被研究清楚，但是對于多年生木本植物缺鐵響應(yīng)的分子機理尚不清楚。
　　植物的Ⅰb類和Ⅳc類bHLH轉(zhuǎn)錄因子在鐵離子的吸收過程中扮演者重要的角色。本研究從蘋果中克隆到一個Ⅳc類bHLH轉(zhuǎn)錄因子基因，命名為Mdb HL H104，RT-PCR分析發(fā)現(xiàn)其表達受缺鐵誘導(dǎo)。為了驗證其功能，將35S∷MdbHLH104過表達載體遺傳轉(zhuǎn)化并獲得了蘋果的轉(zhuǎn)基因植株和愈傷組織

3、;表型分析發(fā)現(xiàn)，在缺鐵條件下，MdbHLH104轉(zhuǎn)基因株系表現(xiàn)出明顯抗缺鐵能力，并且根際質(zhì)子外泌和三價鐵離子還原酶活性都增加，植物體內(nèi)鐵離子含量也比野生型對照高。進一步研究發(fā)現(xiàn)，MdbHLH104蛋白能夠直接結(jié)合到MdAHA8基因(編碼PM H+-ATPases)的和Ⅰb類bHLH轉(zhuǎn)錄因子基因的啟動子上，激活這些基因的表達，從而正調(diào)控PM H+-ATPases的酶活性和Ⅰb類bHLH轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄能力。
　　以MdbHLH104為

4、誘餌蛋白進行酵母雙雜交篩選cDNA文庫，得到一些與MdbHLH104互作的蛋白。酵母雙雜交和Pull-Down分析的結(jié)果表明，MdbHLH104蛋白分別與MdPYE、MdILR3(MdbHLH105)、MdbHLH115、MdbHLH11和MdbHLH121等其他Ⅳc類bHLH轉(zhuǎn)錄因子相互作用，形成異源二聚體共同正調(diào)控下游基因Md4HA8的表達，分別共表達MdbHLH104與MdPYE、MdILR3(MdbHLH105)、MdbHLH1

5、15、MdbHLH11或MdbHLH121明顯增強轉(zhuǎn)基因蘋果愈傷組織中的H+-ATPase活性和鐵含量。
　　此外，還篩選到了2個BTB/POZ-TAZ蛋白MdBT1和MdBT2，序列搜索比對發(fā)現(xiàn)，蘋果基因組還編碼另外三個BTB-TAZ蛋白，分別為MdBT3.1、MdBT3.2和MdBT4，結(jié)構(gòu)域分析表明，5個MdBTs蛋白都含有三個保守的結(jié)構(gòu)域，即N端的BTB/POZ結(jié)構(gòu)域，中間位置的TAZ結(jié)構(gòu)域和C端的鈣調(diào)素結(jié)合結(jié)構(gòu)域。酵母雙

6、雜交、Pull-Down和Co-IP（免疫共沉淀）分析試驗表明，5個MdBTs蛋白中只有MdBT1和MdBT2能夠與MdbHLH104相互作用，具體互作區(qū)域是MdBT1和MdBT2的TAZ結(jié)構(gòu)域和MdbHLH104的C末端區(qū)域。
　　Western雜交分析的結(jié)果顯示，MdbHLH104蛋白在35S∷ MdBT1/2-Anti（反義沉默表達載體）轉(zhuǎn)基因蘋果愈傷組織中的積累水平高于，而在35S∷MdBT2（正義過量表達載體）轉(zhuǎn)基因蘋果

7、愈傷組織中的積累水平低于對照，表明MdBTs蛋白負調(diào)控MdbHLH104蛋白的豐度。深入研究表明，MdBT2蛋白能夠與MdCUL3互作形成CRL3BT2E3泛素化連接酶復(fù)合體，離體和活體泛素化以及體外降解試驗表明，CRL3BT2 E3泛素化連接酶復(fù)合體介導(dǎo)MdbHLH104蛋白的泛素化修飾，進而通過26S蛋白酶體途徑降解，因此，MdBT2蛋白通過MdbHLH104調(diào)控植物體內(nèi)質(zhì)子外泌和鐵離子的吸收及動態(tài)平衡。最后，我們還發(fā)現(xiàn)MdBT1和