鴨梨α-法尼烯合成酶基因的克隆及其植物表達(dá)載體構(gòu)建.pdf

1、α-法尼烯是重要的倍半萜類(lèi)次生代謝物質(zhì)，具有許多重要的生物學(xué)效應(yīng)。α-法尼烯是果實(shí)中主要的香氣成分之一，與昆蟲(chóng)的誘導(dǎo)產(chǎn)卵有關(guān)。Oc一法尼烯是誘導(dǎo)虎皮病發(fā)生的重要因素，虎皮病是梨、蘋(píng)果在低溫貯藏的中后期發(fā)生的最嚴(yán)重的生理病害之一。果皮中α-法尼烯的生物合成是通過(guò)類(lèi)異戊二烯途徑中的甲羥戊酸途徑，在此途徑中調(diào)控α-法尼烯合成的酶主要包括HMGR、FPPS、α-法尼烯合成酶。其中α-法尼烯合成酶是調(diào)控α-法尼烯合成的關(guān)鍵酶，它催化FPP轉(zhuǎn)變?yōu)棣?/p>

2、-法尼烯。近年來(lái)，通過(guò)α-法尼烯合成酶來(lái)研究虎皮病的分子機(jī)制已經(jīng)成為國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。 鴨梨屬于白梨品系，中國(guó)是鴨梨的主要產(chǎn)地。為研究α-法尼烯合成酶基因的功能，本實(shí)驗(yàn)采用改良的CTAB-LiCl法從鴨梨中提取RNA，根據(jù)GenBank注冊(cè)的α-法尼烯合成酶基因序列設(shè)計(jì)特異引物，通過(guò)同源克隆途徑分離了α-法尼烯合成酶基因的編碼區(qū)序列及3’片段序列，通過(guò)酶切和連接等分子生物學(xué)手段構(gòu)建了反義、RNAi中間表達(dá)載體，并通過(guò)凍融法將載體

3、轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌，并用于遺傳轉(zhuǎn)化研究。主要結(jié)果如下： 1 采用改良的CTAB-LiCl法從鴨梨中提取了高質(zhì)量的RNA，經(jīng)過(guò)RT-PCR擴(kuò)增得到了1824bp鴨梨α-法尼烯合成酶基因(PFS)(GenBank注冊(cè)號(hào)：DQ364626)。 2 序列分析發(fā)現(xiàn)該cDNA包含一個(gè)由1728個(gè)核苷酸組成的開(kāi)放閱讀框架，編碼分子量約66KDa的576個(gè)氨基酸殘基的蛋白質(zhì)。序列相似性分析結(jié)果表明，它與蘋(píng)果中克隆得到的α-法尼烯合成酶(AFS)

4、基因具有很高的同源性，與來(lái)源于黃瓜、杉樹(shù)、松樹(shù)的α-法尼烯合成酶基因的同源性較低。且具有兩個(gè)典型的與酶功能相關(guān)的萜類(lèi)合成酶基因保守結(jié)構(gòu)域：位于N端的RRX8W(33-43)和C端的DDXXD(326-330)。系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析表明鴨梨PFS基因?qū)儆谳祁?lèi)合成酶tps b家族。 3 應(yīng)用Northern雜交技術(shù)和高效液相技術(shù)(HPLC)分別檢測(cè)了該基因在不同部位的表達(dá)和α-法尼烯的釋放情況，PFS基因在鴨梨果皮中的表達(dá)量最大，葉中的次

5、之，莖、花、根中的表達(dá)量相對(duì)較少。且PFS基因的表達(dá)與α-法尼烯的積累具有高度的協(xié)同性。 4 為了獲得鴨梨突變體轉(zhuǎn)基因植株，轉(zhuǎn)錄后能有效抑制PFS基因的表達(dá)，利用RT-PCR技術(shù)從鴨梨的果皮中獲得了來(lái)源于α-法尼烯合成酶基因(PFS)編碼區(qū)的兩個(gè)基因片段，反向連接，經(jīng)PCR擴(kuò)增、限制性?xún)?nèi)切酶消化和序列測(cè)定，驗(yàn)證其序列和設(shè)計(jì)的相一致，成功構(gòu)建了抑制α-法尼烯合成酶基因表達(dá)的RNAi表達(dá)載體PBI-l-S。 5 成功構(gòu)建了反