胚胎肝干細胞的增殖、分化及其調(diào)控因素.pdf

1、由于肝干細胞具有自我復制和雙向分化潛能，故肝干細胞可望成為嚴重肝疾患細胞替代療法以及構(gòu)成生物人工肝的供體細胞，也因此使其成為當前的一個研究熱點。 Suzuki、Dabeva、Allain、Malli等人分別利用FACS方法從大鼠、小鼠、獼猴和人胚胎肝中分離出的肝干細胞，在體外進行單細胞克隆培養(yǎng)，觀察其分化潛能、細胞的形態(tài)特征及其所表達的標志物。 Jung等在動物實驗上觀察到，來自心肌細胞的成纖維細胞生長因子(Fibrob

2、lastgrowthfactor，F(xiàn)GF)信號可誘導alb和afp等肝特異基因的表達。Matsumoto等提出在肝內(nèi)血管形成和發(fā)揮功能之前，橫隔間充質(zhì)中的內(nèi)皮細胞就對肝芽的形成提供了重要的生長信號。Parviz等利用基因剔除的小鼠模型，發(fā)現(xiàn)肝干細胞的增殖、分化受肝細胞核因子4α(Hepatocytenuclearfactor4α，HNF4α)、HNF6、HEX、含亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)域的CCAAT/增強子結(jié)合蛋白α (CCAAT/en

3、hancerbindingproteinα，C/EBPα)等轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控?？傊?，近年來肝干細胞的研究雖然取得了很大的進展，但還存在許多有待解決的問題。對于肝干細胞在胚胎肝發(fā)育過程中的形態(tài)學特征、時空分布、分化過程的報道很少；對心肌細胞、橫隔間充質(zhì)細胞及血管內(nèi)皮細胞對肝發(fā)育的誘導的分子機制不清楚；對于造血細胞對肝干細胞的發(fā)育有無影響未見報道。對人胚胎肝干細胞的研究資料尤為缺乏，而對人胚胎肝干細胞的研究，所得資料直接反映其生物學特征，避免

4、了用模式生物進行研究所得的資料還需要在人體再加證實的過程，結(jié)果可望直接用于肝干細胞的應用研究及其臨床應用。因此本研究擬觀察下述內(nèi)容，以探討肝干細胞的形態(tài)學特征、增殖分化過程以及調(diào)控肝干細胞增殖、分化的微環(huán)境。 ①觀察第3～12周人胚胎肝干細胞的時空分布、形態(tài)學特征、表型及增殖、分化過程。 ②觀察由心肌細胞、橫隔間充質(zhì)細胞、血管內(nèi)皮細胞及造血細胞等合成的、可能對肝干細胞增殖、分化起調(diào)節(jié)作用的因子的時空表達。③肝干細胞在增殖

5、分化過程中自我合成、分泌的因子的時空表達。④肝細胞核轉(zhuǎn)錄因子HNF4α和HNF6在發(fā)育各期小鼠胚胎肝干細胞的表達時相和細胞定位。 1.材料與方法1.1標本的收集、處理及胚胎齡的判斷收集受精齡為3月以內(nèi)的新鮮人胚胎標本228例，常規(guī)石蠟包埋、連續(xù)切片，HE染色，根據(jù)體節(jié)的數(shù)目及器官發(fā)育狀況確定胚胎齡。1.2形態(tài)觀察①胚胎肝與原始橫隔和心臟在發(fā)育過程中的位置關(guān)系。 ②肝干細胞的形態(tài)學特征和增殖、分化過程。 ③血管內(nèi)皮

6、細胞、造血細胞、心肌細胞及橫隔間充質(zhì)細胞形態(tài)變化和增殖、分化過程。 1.3免疫組化染色AFP、c-Met、CK19、PCNA、CD10、CD14、CD34、HGF、IGF-I、TGFβ1、VEGFA、VEGFC及其受體，共20種抗體免疫組化染色，觀察它們在肝干細胞、血管內(nèi)皮細胞、造血細胞、心肌細胞及橫隔間充質(zhì)細胞中的表達，以了解：①肝干細胞的表型特征。 ②相鄰的心肌細胞、橫隔間充質(zhì)細胞、血管內(nèi)皮細胞和造血細胞對肝干細胞增

7、殖、分化的影響。 ③通過觀察上述因子和受體在不同類型細胞中的時空表達，了解這些因子的作用方式和作用時相。 1.4RT-PCR法和原位雜交：觀察肝細胞核轉(zhuǎn)錄因子HNF4αmRNA和HNF6mRNA在發(fā)育各階段小鼠肝中的表達，了解HNF4α和HNF6在小鼠胚胎肝干細胞增殖、分化過程中的作用。 2.結(jié)果與討論2.1肝干細胞的觀察第3～5W人胚肝細胞排列緊密，較小，形態(tài)不規(guī)則，核圓形或卵圓形，核質(zhì)比例大，核深染，胞質(zhì)顏色

8、較淡，偏藍色，顯示出幼稚細胞的形態(tài)學特征，并呈甲胎蛋白(α-Fetoprotein，AFP)、c-Met陽性反應，提示為肝干細胞。第6～9W開始肝索內(nèi)出現(xiàn)了體積大、核大、淡染的細胞，表明此階段肝干細胞已經(jīng)處于分化階段，生成了肝細胞，而肝干細胞的數(shù)量逐漸下降，在胚胎肝內(nèi)彌散分布。第10～12W，AFP、c-Met陽性細胞主要分布于匯管區(qū)周圍，提示此時肝干細胞主要局限于匯管區(qū)周圍的肝索內(nèi)，與成年肝中卵圓細胞(成年肝干細胞)的分布一致。說明第

9、10～12W肝小葉形成后，肝干細胞的分布與成年肝干細胞的位置相似，并可能一直保留在此處。細胞角蛋白19(cytokertin19，CK19)陽性反應在第7W時開始出現(xiàn)。第10～11W時，CK19陽性反應主要位于匯管區(qū)附近的肝索細胞和膽管板細胞及膽管上皮細胞。第12W時，CK19陽性信號僅見于膽管板和膽管上皮細胞。此時所有的膽管板細胞及膽管上皮細胞均呈AFP、c-Met和CK19陽性，因此AFP+/c-Met+/CK19+細胞可能為膽管祖

10、細胞。 2.2生長因子及其受體在肝干細胞、內(nèi)皮細胞、造血細胞、 心肌細胞和橫隔間充質(zhì)細胞中的表達人胚胎第3～10W肝干細胞不表達肝生長因子(Hepatocytegrowthfacto，HGF)，但表達HGF的受體c-Met，而此時鄰近的造血細胞、心肌細胞、橫隔間充質(zhì)細胞為HGF免疫反應陽性，提示造血細胞、心肌細胞、橫隔間充質(zhì)細胞產(chǎn)生的HGF可能通過旁分泌途徑與肝干細胞表達的c-Met結(jié)合，為人胚胎肝干細胞提供生長信號。H

11、GF/c-Met系統(tǒng)在肝內(nèi)的表達早于其他生長因子，在肝芽生成階段即出現(xiàn)，并且一直維持較高水平的c-Met，因此本文推測HGF可能在人胚肝發(fā)育的啟動和肝干細胞的增殖分化過程中都起到重要作用。 第3～4W時，胰島素樣生長因子1(Insulin-likegrowthfactorI，IGF-I)、轉(zhuǎn)化生長因子(transforminggrowthfactor-betal，TGF-B1)及其受體在肝索細胞、造血細胞及內(nèi)皮細胞中均無表達。第

12、5～12W，可觀察到肝索細胞、造血細胞、心肌細胞以及橫隔間充質(zhì)細胞為IGF-I及其受體IGF-IR、TGFB1及其受體TGFBR1、TGFBR2陽性反應。提示IGF-I、TGFβ1可能在人胚肝發(fā)生的啟動階段無明顯作用，與Randal等的報道不同。在5W之后，造血細胞、心肌細胞及橫隔間充質(zhì)細胞分泌的IGF-I、TGFβ1等可能通過旁分泌途徑調(diào)節(jié)肝干細胞的增殖、分化，同時，肝干細胞本身產(chǎn)生的IGF-I、TGFβ1也可通過自分泌途徑發(fā)揮作用。

13、其中IGF-I的作用可能協(xié)同HGF的促增殖作用，TGFβ1可通過旁分泌和自分泌途徑抑制肝干細胞數(shù)目的過度增加、并促進其分化。 胚胎第3～12W的橫隔間充質(zhì)細胞、心肌細胞呈血管內(nèi)皮細胞生長因子A(VascularendothelialgrowthfactorA，VEGFA)強陽性，而其受體fms樣酪氨酸激酶(fms-liketyrosinekinase，flt1)和胎肝激酶1(fetalliverkinasel，flk1)在肝干細

14、胞中均有表達。這說明心肌細胞和橫隔間充質(zhì)細胞分泌的VEGFA可通過旁分泌途徑調(diào)節(jié)肝干細胞的增殖、分化。此時造血細胞亦表達VEGFA，提示造干血細胞產(chǎn)生的VEGFA對肝干細胞亦具有調(diào)節(jié)作用。第4、5w時，靠近原始肝的橫隔間充質(zhì)中的血管內(nèi)皮細胞中亦有VEGFA的表達，提示此時VEGFA可介導橫隔間充質(zhì)組織中的血管內(nèi)皮細胞對肝干細胞增殖、分化的誘導作用。第4～6W，少數(shù)肝細胞呈VEGFA免疫反應陽性，表明此時VEGFA亦可通過自分泌途徑發(fā)揮作

15、用。本文首次注意到VEGFA及其受體flt1和flk1在人胚胎肝干細胞中的表達，提出VEGFA可能介導橫隔間充質(zhì)細胞、心肌細胞、造血細胞、肝外血管內(nèi)皮細胞對肝干細胞增殖、分化的作用。 第4～12W，多數(shù)肝細胞中均有VEGFC強陽性反應。第3～7W的心肌細胞與橫隔間充質(zhì)細胞中可見VEGFC免疫反應陽性細胞。第4、5w時，靠近原始肝的橫隔間充質(zhì)中的血管內(nèi)皮細胞中亦有VEGFC的表達。而肝干細胞中有其受體flt4免疫反應。說明心肌細胞

16、、橫隔間充質(zhì)細胞和肝外的血管內(nèi)皮細胞分泌的VEGFC可通過旁分泌途徑調(diào)節(jié)肝干細胞的增殖、分化，肝干細胞所產(chǎn)生的VEGFC通過自分泌途徑自我調(diào)節(jié)其發(fā)育。 總之，肝干細胞的增殖、分化過程受內(nèi)皮細胞、造血細胞、原始心肌和橫隔間充質(zhì)細胞等的調(diào)節(jié)，HGF、IGF-I、TGFβ1、VEGFA、VEGFC等因子可通過旁分泌和/或自分泌途徑調(diào)節(jié)胚胎肝干細胞的增殖、分化。 2.3HNF4αmRNA在小鼠肝發(fā)育過程中的表達RT-PCR結(jié)果顯

17、示HNF4α在肝中的表達始于胚胎發(fā)育的第9d，并持續(xù)到新生，至成年時表達減弱。原位雜交顯示，肝索的多數(shù)細胞均呈HNF4α陽性反應，成年時仍有少數(shù)呈HNF4α陽性的肝細胞，而膽管板及膽管上皮細胞、血管內(nèi)皮細胞、造血細胞等均為陰性。說明在胚胎發(fā)育過程中HNF4αmRNA表達與肝芽的形成有關(guān)，并參與肝干細胞向肝細胞的增殖、分化的過程，其在正常成年肝中表達可能與肝細胞分化狀態(tài)的維持有關(guān)。 2.4HNF6mRNA在小鼠肝發(fā)育過程中的表達H