Dact2在肝癌中的表觀遺傳學變化及功能研究.pdf

1、肝細胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是我國常見的惡性腫瘤之一，嚴重危害人類健康。肝癌的發(fā)病機制很復雜，表現(xiàn)遺傳學改變調控的wnt/β-catenin信號通路相關基因失活在肝癌發(fā)生中發(fā)揮了重要作用。Dact（Homo sapiens dapper，antagoni st of β-catenin）是wnt/β-catenin信號通路的負性調節(jié)基因家族。有研究表明Dact1和Dact3的表達分別受DNA甲基化

2、和組蛋白修飾等表觀遺傳學調控，具有抑制腫瘤發(fā)生的作用。但Dact2與腫瘤的關系研究文獻報道很少，在肝癌中的表現(xiàn)遺傳學變化及功能尚不清楚。
　　 目的：
　　 1.檢測Dact2在永生化肝細胞系和肝癌細胞系中的表達及甲基化改變。
　　 2.檢測Dact2在正常肝組織、癌旁組織及不同分化程度肝癌組織中的表達及意義。
　　 3.檢測Dact2在肝癌組織中的甲基化改變。
　　 4.探討肝癌組織中DNA甲基

3、化與Dact2表達之間的關系。
　　 5.檢測Dact2對肝癌細胞生長的影響。
　　 6.探討Dact2抑制肝癌細胞生長的可能機制。
　　 方法
　　 1.RT-PCR和western blot檢測細胞系中Dact2在甲基轉移酶抑制劑5-aza-dc處理前后mRNA及蛋白的表達。
　　 2.甲基化特異性PCR（methylation specific PcR，MSP）檢測細胞系和組織標本DNA中D

4、act2甲基化情況。
　　 3.免疫組織化學方法檢測Dact2在正常肝組織、癌旁組織及不同分化程度肝癌組織中的表達分布。
　　 4.脂質體法轉染Dact2真核表達載體，流式細胞分選結合G418篩選瞬時轉染Dact2的細胞。
　　 5.克隆形成實驗及BrdU摻入標記方法分析Dact2對細胞生長的影響
　　 6.Hoechst 33258染色分析Dact2對細胞凋亡的影響。
　　 結果：
　　

5、 1.Dact2在肝癌細胞系中的表達及甲基化改變本課題選用5株肝癌細胞系：HepG2、SNU449、SMMC7721、SNU182、PLC-PRF-5和一株永生化的肝細胞系Lo.2。在mRNA水平，Dact2在SNU449細胞系中無表達，在HepG2、SNU182、SMMC7721表達較弱，在Lo.2和PLC-PRF-5細胞中表達正常；5-aza-dc處理后，HepG2、SMMC7721、SNU182細胞中Dact2較未處理時表達上調，

6、而L0.2、PLC-PRF-5和SNU449中Dact2無改變。選取HcoG2和SNU182兩株細胞系檢測Dact2蛋白的表達，結果顯示Dact2蛋白在5-aza-dc處理后上調，與mRNA水平的表達改變一致。MSP檢測結果顯示10.2和PLC-PRF-5中Dact2為非甲基化，HepG2、SNU449、SMMC7721、SNU182細胞系中存在甲基化改變，其中，SNU182、SNU449和SMMC7721細胞中同時有甲基化和非甲基化條

7、帶。Dact2啟動子甲基化改變與基因表達呈對應關系。
　　 2.Dact2在肝癌組織標本中的表達及甲基化情況在表達部位上，Dact2在正常肝組織、癌旁組織和癌組織中表達均在細胞漿；在表達強度上，肝癌組織內Dact2表達較癌旁明顯減低，兩組比較有統(tǒng)計學意義（P<0.001）；在高分化和中分化肝癌組織中Dact2的表達顯著高于低分化組（P<0.05），而與患者的年齡、姓別、腫瘤大小及HBV相關性肝癌無顯著相關。38例肝癌組織中的Da

8、ct2甲基化率為60.5％；在16例表達下調的肝癌標本中檢測到Dact2甲基化的有11例（68.75％）。
　　 3.恢復Dact2表達對腫瘤細胞生長的影響克隆形成實驗結果顯示恢復Dact2表達后hepG2細胞的克隆數(shù)量明顯少于對照轉染的空載體，Dact2對細胞長期生長抑制作用大于空載體的2倍。Brdu摻入標記后轉染Dact2的陽性細胞為39.63％，明顯少于空質粒組48.32％，兩組比較有顯著差異（P<0.05）。
　　

9、 4.Hoechst 33258染色分析Dact2對細胞凋亡的影響轉染Dact2后HcpG2的凋亡率為10.9％，而轉染空質粒的凋亡率4.9％；SNU449細胞轉染Dact2后細胞凋亡率為12.30％，轉染空質粒的凋亡率12.10％，提示Dact2對細胞凋亡無明顯影響。結論本課題檢測了肝癌中Dact2的表達及DNA甲基化改變，5-aza-dc處理細胞系能恢復dact2的表達，表明在肝細胞癌中Dact2的表達受表現(xiàn)遺傳學調控；恢復表達D