豬卵丘細胞核移植過程中卵母細胞末期去核相關問題研究.pdf

1、在核移植過程中，供核細胞與受體胞質是重構胚的兩個重要構件，尤其是受體胞質對重構胚核基因的重新編程及胚胎的發(fā)育至關重要。目前，大多數研究者都是采用MII期卵母細胞作為受體胞質。但是該方法由于在去核時要抽取大量胞質，而且還要用紫外線照射以檢查去核是否完全，因而對細胞損傷大影響重構胚的發(fā)育。近年來有人采用激活MII期卵母細胞待其排出第二極體后，抽取第二極體及其周圍少量含核的胞質來達到去核的目的，又稱為TII期去核。這種方法由于抽取的胞質少，而

2、且不需要紫外線的照射，故而對細胞的損傷較小。 許多實驗室對該方法進行了研究，但是關于卵母細胞TII期去核對豬體細胞核移植重構胚發(fā)育的影響，目前國內還尚無相關報道。本論文主要研究和比較了豬卵母細胞TII期去核方法與效果，在此基礎上還對豬卵母細胞TII期去核法生產核移植胚胎的程序進行了優(yōu)化，為推廣應用該技術生產豬的體細胞核移植胚胎提供一些數據和經驗。 本實驗在原有豬體細胞核移植技術的基礎上，對影響豬卵母細胞TII期去核重構胚

3、發(fā)育的幾個因素(卵母細胞預激活程序、核移植后核質作用時間以及核供體細胞預處理方法)進行如下實驗。 1、豬卵母細胞TII期預激活物質的選擇。本實驗以第二極體排出比率為指標，分別選擇不同濃度的三種物質，作用于豬成熟卵母細胞觀察統(tǒng)計預激活效果。5％、7％和10％乙醇濃度預激活豬卵母細胞排出第二極體的比率分別為20.83％(25/120)、25.00％(30/120)和22.50％(27/120)；采用濃度為μg/mL、6μg/mL、8

4、μg/mL，和10μg/mL的放線菌酮預激活豬卵母細胞后，第二極體的排出率分別為：16.67％(20/120)、19.17％(23/120)、25.83％(31/120)和20.83％(25/120)；濃度為5μmol/mL、10μmol/mL、15μmol/mL和20μmol/mL鈣離子載體A23187(CaA)預激活豬卵母細胞后第二極體的排出效果為54.17％(65/120)、58.33％(70/120)、64.17％(77/120

5、)和57.50％(69/120)，15μmol/mL，組效果最好，各濃度之間差異不顯著(p>0.05)。比較以上三種物質預激活豬卵母細胞的效果發(fā)現15μmol/mL的CaA極顯著優(yōu)于其他兩種物質(p<0.01)。 2、不同受體卵母細胞胞質對豬體細胞核移植的影響。本實驗以重構胚卵裂率和4-細胞以上胚胎發(fā)育率為檢測統(tǒng)計指標，以MII期中期去核和TII期去核的卵母細胞作為受體胞質，經血清饑餓的卵丘細胞作為核供體構建重構胚胎，比較兩種受

6、體胞質對豬體細胞核移植效果的影響。結果表明：MII期中期去核的卵母細胞為核受體胞質的卵裂率和4-細胞以上胚胎發(fā)育率均高于TII期去核的卵母細胞(31.67％vs24.17％，14.17％vs10.83％)，差異顯著(p<0.05)。說明，MII期中期去核的卵母細胞更適宜作為核移植受體胞質。 3、不同核質作用時間對豬體細胞核移植的影響。采用電融合法將卵丘細胞移入去核的卵母細胞中，供體細胞在TII期去核的受體胞質內分別孵育0h、1h、2h、

7、3h、4h和5h后，1.3kV/cm、80μs、單次脈沖電激活重構胚，以重構胚卵裂率和4．細胞以上胚胎發(fā)育率為檢測統(tǒng)計指標，比較不同核質孵育時間對核移植效果的影響。結果表明：核質孵育4h可以獲得較好的核移植效果，其卵裂率(35.83％(45/120))顯著高于其他幾組(22.50％、25.83％、26.67％、28.83％、30.83％，p<0.05)。4-細胞以上胚胎發(fā)育率與孵育3h組差異不顯著(12.50％vs12.50％,p>0.

8、05)。但與其它幾組相比差異顯著(12.50％vs 4.17％，9.17％，10.00％，7.50％,p<0.05)。說明用TII期去核卵母細胞作為核受體胞質，核質孵育4h后再進行補充性電激活可以提高豬體細胞核移植重構胚的發(fā)育率。 4、不同供核細胞預處理方法對核移植效果的影響。本實驗將經過血清饑餓處理的卵丘細胞作為對照組，分別用7％乙醇和鈣離子載體A23187(5μmol/L)預處理供核細胞，核移植重構胚融合后，核質孵育4h再激

9、活，比較兩種預處理方法對核移植重構胚的影響。結果表明：用CaA預處理組的核移植重構胚的卵裂率(37.50％vs30.83％)和4-細胞以上胚胎發(fā)育率(15.83％vs10.83％)均高于對照組，差異顯著(p<0.05)。卵裂率也略高于乙醇預處理組的核移植重構胚卵裂率(37.50％vs34.16％，p>0.05)，但是4-細胞以上胚胎發(fā)育率顯著高于乙醇預處理組(15.83％vs9.17％，p<0.05)。由此可見，TII期去核的卵母細胞作

10、為核受體胞質，用鈣離子載體預處理核供體細胞，核質孵育4h再激活重構胚，有利于核移植重構胚的發(fā)育。 綜上所述，在以TII期去核的豬卵母細胞作為核受體胞質時，最適宜的程序是：用濃度為15μmol/mL鈣離子載體處理卵母細胞5min，然后抽取第二極體及其周圍少量胞質進行去核。供核細胞用5μmol/mL鈣離子載體預處理后注入TII期去核的豬卵母細胞卵周隙內，采用參數為1.0kV/cm、80μs、單次脈沖電融合法移入供體細胞核，構建重構胚