反式7，8-二羥-9，10-環(huán)氧苯并（a）芘誘發(fā)細胞應答反應的劑量效應和時間效應的蛋白質組學研究.pdf

1、苯并(a)芘(BaP)屬于多環(huán)芳烴類(PAHs)環(huán)境化學污染物,主要由煤、煙草和其它一些有機化合物高溫加熱或燃燒不完全時產生.苯并(a)芘在體內經微粒體酶代謝活化后生成終致癌物7,8-二羥-9,10-環(huán)氧苯并(a)芘(benzo(a)pyrene-7,8-dihydrodiol-9,10-epoxide,BPDE),其中反式-BPDE是代謝產物中活性最強的,具有親電性碳原子活性基團,能與組成核酸的堿基和組成蛋白質的氨基酸的親核基團共價結

2、合形成加合物,損傷生物大分子的結構和功能,從而引發(fā)核苷酸切除修復,DNA跨損傷復制,細胞周期"校正點"等信號通路的激活,以及基因表達的改變. BPDE是一個全致癌物,兩階段致癌實驗表明它既是致癌劑又是促癌劑.其中,BPDE在癌變發(fā)生啟動期的機制已經得到了廣泛研究,主要是導致DNA突變形成:BPDE第10位上的C與DNA鳥嘌呤的N<'2>位形成加合物(+)-trans-anti-BPDE-N<'2>-dG,它們將阻斷DNA復制,通過

3、細胞的DNA合成機構的旁路合成途徑,即跨損傷DNA合成(translesion DNA synthesis,TLS),細胞可以避免這些未經修復的損傷對細胞的致死性影響,但在損傷堿基的對面常插入錯配的堿基,通常是G→T的堿基顛換突變,導致細胞面臨基因突變的風險. 與BPDE的致突變機制廣泛研究相反的是,BPDE誘發(fā)的細胞早期反應中是如何影響信號轉導通路從而激活轉錄因子和它們的靶基因表達所知甚少.現在的研究發(fā)現BPDE作用后p53,

4、PI-3K/Akt/JNKs,MAPKs/AP-1,IKKbeta/NF-kappaB等信號通路被激活.為了研究BPDE對基因表達的直接影響,用DNA免疫沉淀技術鑒定并克隆BPDE結合的DNA片段,總共得到67個基因片段.這些片段經測序并與GenBank數據庫BLAST之后,發(fā)現其功能包括DNA修復,凋亡相關,鋅指蛋白,酶,表達序列標簽克隆,CpG島.這些數據進一步說明BPDE與相關基因DNA直接結合也是誘導基因表達變化的一個重要機制.

5、與此同時,高通量的基因芯片技術也被用于檢測BPDE暴露后,細胞中基因發(fā)生的全局變化和涉及的信號通路.Akerman等用含有350個人類基因的芯片發(fā)現BPDE處理后改變的基因涉及:細胞周期調控,谷胱甘肽解毒,細胞凋亡等等. 在毒理學研究中,我們通常要考慮細胞或動物暴露于環(huán)境污染物后的劑量反應關系.但是,用能誘導非毒性、亞毒性或毒性反應的不同濃度的外來污染物作用后,有時候不一定能得到良好的劑量依賴關系,甚至于能誘導機體產生完全不同的

6、反應.Moller等人的研究結果發(fā)現用低、中、高三個濃度道諾紅菌素(daunorubicin)處理細胞后,差異蛋白質組顯示道諾紅菌素能導致20個蛋白的表達水平在三個濃度都上調,大部分不具有劑量依賴關系. 除了暴露劑量,暴露后的時間間隔也是一個需要考慮在內的重要因素.隨著暴露后時間的延長,可以發(fā)現與時間相關毒性反應的可觀察的基因或蛋白表達改變,有助于了解早期反應和晚期反應的作用機制和尋找相關的生物標記物. 本實驗室曾用苯并

7、[a]芘處理細胞,引起廣泛的蛋白表達改變,其中以鋅指蛋白和一些參與轉錄調控的蛋白多見.為了消除苯并[a]芘的代謝轉化效率差異的影響,我們隨后采用苯并[a]芘的代謝終產物BPDE進行深入研究,用低濃度0.005gM BPDE處理FL細胞,在細胞外液中發(fā)現有3個出現的蛋白點,16個表達上調的蛋白點.為了更好的了解細胞反應的全貌,實驗中還用不同的暴露劑量以期獲得更多的信息來闡明細胞對BPDE的應答機制.應用基因芯片技術分別檢測0.005μM、

8、0.05gM、0.5μMBPDE暴露后基因表達的改變并用實時定量RT-PCR進行驗證,發(fā)現在低濃度0.005μM和0.05μM濃度組發(fā)生改變的基因較少,而高濃度0.5μM發(fā)生改變的基因數目較多,這些基因的功能涉及細胞周期調節(jié)、信號轉導、轉錄因子、代謝有關的酶等.可能涉及的信號通路包括:p53,MAPK,Akt/PKB.劉更等發(fā)現用低濃度0.005μgM和0.05μM BPDE可以誘導內質網應激反應(endoplasmic reticul

9、um stress,ER stress),但較高濃度0.5μM BPDE未見類似變化. 以上這些實驗結果使我們迫切想揭示不同濃度BPDE暴露和暴露后不同時間細胞發(fā)生的變化.近年來,生物技術的飛速發(fā)展使得更全面廣泛的了解這種變化成為可能.許多高通量技術如cDNA芯片,實時RT-PCR,以及生物信息學已被用于細胞應激反應,實驗結果令人鼓舞.但是這些技術都不能提供轉錄后的尤其是蛋白質在翻譯后修飾的信息,而蛋白質通常是細胞內的功能執(zhí)行者

10、.以雙向電泳(2-DE)作為分離技術和質譜作為鑒定技術的蛋白質組學的方法能同時分離細胞內幾千個蛋白,并能研究翻譯后修飾以及蛋白的相互作用,因此在相關領域中受到廣泛的應用. 因此,在本研究中,應用雙向電泳和基質輔助激光解吸飛行時間質譜(MALDI-TOF)相結合的蛋白質組學方法來篩選不同濃度BPDE暴露和暴露后不同時間哺乳動物細胞的差異表達蛋白,研究可能存在的差異表達蛋白與BPDE濃度、作用時間的關系,找尋對BPDE有特異反應的蛋

11、白.通過生物信息學方法對差異蛋白進行分類,探討不同功能蛋白對BPDE的響應可能對細胞產生的毒性影響. 本文用BPDE處理FL細胞,二甲基亞砜作為溶劑對照組,然后提取細胞總蛋白.采用24cm,pH 4-7的IPG膠條及同時可跑12塊膠的Ettan DALT Ⅱ垂直電泳系統(tǒng)進行分離,銀染的膠經數字化成像和圖象分析后發(fā)現:量效關系中有65個蛋白斑點在BPDE處理后12小時發(fā)生了顯著的變化.其中有1個斑點在0.05μM和0.5μM BP

12、DE處理后的細胞中檢測到,1個斑點僅在0.5μM BPDE處理后的細胞中檢測到;另外有24個蛋白斑點在0.005μM BPDE處理后表達量發(fā)生改變(11個上調,13個下調),24個蛋白斑點在0.05μM BPDE處理后表達量發(fā)生改變(16個上調,8個下調),25個蛋白斑點在0.5μM BPDE處理后表達量發(fā)生改變(14個上調,11個下調),有10個蛋白斑點在兩個處理劑量組都發(fā)生了改變,沒有蛋白斑點在三個劑量組都發(fā)生改變.進一步的,我們切

13、取膠上的差異蛋白斑點,然后用特異性的胰酶消化,酶解后的肽段用基質輔助的激光解吸離子化-飛行時間質譜(MALDI-TOF)鑒定,得到各個蛋白的肽質指紋圖譜(peptide mass fingerprinting,PMF).根據肽質指紋圖,在網上用MASCOI、搜索軟件分別搜尋NCBI的非冗余蛋白序列數據庫(nrNCBI),46個蛋白質得到了鑒定.這些得到成功鑒定的蛋白質功能涉及面非常廣,包括轉錄調控,細胞周期,細胞增殖,信號轉導,細胞骨架

14、,發(fā)育,代謝以及其他功能未明的等等.表明BPDE對細胞產生了廣泛的影響. 在時效研究中發(fā)現用0.05μMBPDE處理后3小時,12小時和24小時,一共有128個蛋白斑點的表達發(fā)生了改變.36個蛋白斑點在0.05μM BPDE處理后3小時表達量發(fā)生改變(11個上調,25個下調),29個蛋白斑點在0.05μM BPDE處理后12小時表達量發(fā)生改變(20個上調,9個下調),69個蛋白斑點在0.05μBPDE處理后24小時表達量發(fā)生改變

15、(35個上調,34個下調),有6個蛋白斑點在兩個處理時間點都發(fā)生了改變,沒有蛋白點在三個處理時間點都發(fā)生改變.其中84個斑點得到了成功鑒定.與量效研究相似的是,時效研究中這些得到成功鑒定的蛋白質功能涉及面也非常廣,幾乎涵蓋了量效中改變蛋白的各個類別.結論:BPDE作用后細胞內發(fā)生了廣泛的變化,有眾多蛋白參與了應答反應,這些蛋白涉及到細胞的不同功能,為進一步研究BPDE與機體交互作用的分子機制提供了線索,并為尋找人群接觸環(huán)境致癌物后的生物