缺氧-氧再灌注誘導心肌細胞衰老的機制及其干預研究.pdf

1、衰老是細胞脫離細胞周期并不可逆地喪失增殖能力后進入一種相對穩(wěn)定的狀態(tài)。自Hayflick等首次從人類纖維原細胞發(fā)現(xiàn)衰老現(xiàn)象后，人們逐漸發(fā)現(xiàn)人類其它各類細胞和其它物種的纖維細胞也存在著衰老。細胞發(fā)生衰老以后主要表現(xiàn)在細胞周期的改變、13．半乳糖苷酶活性的變化、線立體的皺縮與衰老基因的表達增加等。細胞衰老可以促進生物衰老，不僅與腫瘤發(fā)生有關，而且與心力衰竭、動脈粥樣硬化、心律失常等心血管疾病發(fā)生有著密切的關系。因此，深入研究衰老的機制有著重

2、要意義。 缺氧-氧再灌注是細胞、組織與器官最常見的損傷因素，也是誘導細胞發(fā)生衰老的常見方法。最近國外有研究顯示缺氧與氧再灌可以使骨髓造血細胞發(fā)生衰老。 他汀類藥物通過抑制3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶的活性而抑制膽固醇的合成，常用來治療高膽固醇血癥，他汀類藥物還可降低冠心病患者的死亡率、提高心臟移植患者的生存率、改善心肌重構等作用。除了調節(jié)膽固醇代謝外，最近Assmus等報道他汀類藥物可通過上調細胞周期蛋白，下調細胞周期抑

3、制因子p27K<'kipl>，抑制內皮祖細胞的衰老。Pravastatin除了心血管保護作用給患者帶來的益處外，是否同時具有抑制缺氧/氧再灌注誘導心肌細胞衰老，對心臟產生保護作用呢? 在本研究中，將了解缺氧/氧再灌注是否能誘導培養(yǎng)SD乳大鼠心肌細胞發(fā)生衰老；研究缺氧/氧再灌注誘導培養(yǎng)SD乳大鼠心肌細胞發(fā)生衰老的機制；并擬采用pravastatin對缺氧/氧再灌注誘導SD乳大鼠心肌細胞的衰老進行干預，觀察細胞周期與β-半乳糖苷酶活

4、性等經典的細胞衰老指標的變化，以探討pravastatin是否對心肌細胞衰老有抑制作用及可能機制。 第一部分 SD乳大鼠心肌細胞的培養(yǎng)、鑒定與缺氧/氧再灌注誘導建立SD乳大鼠心肌細胞衰老模型 目的：在成功分離、培養(yǎng)SD乳大鼠心肌細胞的基礎上，探討獲得較純心肌細胞的方法以及采用缺氧/氧再灌注誘導建立SD乳大鼠心肌細胞衰老模型的可行性。 方法：采用胰蛋白酶消化心肌組織分離單個心肌細胞，聯(lián)合差速貼壁與培養(yǎng)基中加入Brd

5、u殺死心肌成纖維細胞。心肌細胞在含1％O<.2>與99％N2的孵育箱中缺氧培養(yǎng)6 h，在21％02與5％CO<,2>孵育箱中進行氧再灌注培養(yǎng)24和48 h，建立心肌細胞衰老模型。采用免疫組化檢測培養(yǎng)細胞α-actin表達情況；透射電鏡觀察心肌細胞超微結構改變：BrdU摻入試驗了解心肌細胞增殖情況；流式細胞儀檢測細胞周期；β-半乳糖苷酶試劑盒檢測β-半乳糖苷酶活性。 結果：經α-actin抗體鑒定顯示分離培養(yǎng)的細胞中95％以上是心

6、肌細胞。心肌細胞經缺氧/氧再灌注誘導后，細胞體積變大、線立體明顯皺縮。 細胞增殖結果顯示缺氧/氧再灌注組心肌細胞Brdu陽性率較對照組有顯著下降(P<0.01)；細胞周期檢測結果顯示缺氧/氧再灌注組心肌細胞G0/G1期細胞較對照組有顯著增多(P<0.01)，S期細胞較對照組有顯著減少(P<0.01)；α-半乳糖苷酶活性檢測結果顯示氧再灌注組心肌細胞β-半乳糖苷酶活性較對照組與缺氧6 h有顯著提高(P<0.01)。 結論：

7、 1．采用胰蛋白酶消化心肌組織分離心肌細胞，聯(lián)合差速貼壁與培養(yǎng)基中加入Brdu殺死心肌成纖維細胞，可以獲得較純的心肌細胞，經α-actin抗體鑒定顯示分離培養(yǎng)的細胞中95％以上是心肌細胞。 2．我們首次采用缺氧／氧再灌注，成功誘導建立了SD乳大鼠心肌細胞衰老模型，為心肌細胞衰老機制的研究提供了穩(wěn)定可靠的模型。 第二部分 缺氧/氧再灌注誘導 SD 乳大鼠心肌細胞衰老的機制研究 目的:從細胞周期調控方面探討缺

8、氧/氧再灌注誘導 SD 乳大鼠心肌細胞衰老的分子機制 方法：采用teal-time quantitative PCR與western blot方法檢測培養(yǎng)SD乳大鼠心肌細胞在對照組、缺氧6 h、氧再灌注24和48 h，心肌細胞周期相關蛋白(D1)，細胞周期依賴激酶(CDK4)，細胞周期蛋白和細胞周期依賴激酶復合物抑制劑(p21WAF1，p16IN4Ka)，Rb蛋白，p53等基因的mRNA與蛋白水平的表達變化。 結果：

9、 (1)Cyclin D1與β-actin基因mRNA水平的比值在缺氧6 h、氧再灌注24和48 h分別為O.024，O.082，0.092，與對照組0.005相比有顯著增高(P

10、基因mRNA水平比值在缺氧6 h、氧再灌注24和48 h，分別為O.008，0.005，O.005與對照組O.011相比有顯著降低(P

11、RNA水平比值在缺氧6 h、氧再灌注24和48 h，分別為0.009，O.009，0.012與對照組O.006相比有顯著增高(P

12、RNA水平比值在缺氧6 h、氧再灌注24和48 h，分別為O.002，0.003，0.004與對照組0.001相比有顯著增高(P

13、，O.003，與對照組O.002相比有顯著增高(P

14、照組0.001相比有顯著增高(P

15、對缺氧/氧再灌注誘導SD乳大鼠心肌細胞衰老的干預研究 目的:了解pravastatin對缺氧/氧再灌注誘導SD乳大鼠心肌細胞衰老是否有抑制作用及其機制。 方法：Pravastatin干預濃度為lO<'-7>-10<'-5>mol/1，方法參考第一部分方法。 結果：Pravastatin干預后對照組、缺氧6 h、氧再灌注24和48 h的G0/G1期細胞分別為71.98％，86.47％，84.98％，88.78％較實

16、驗組72.71％，87.45％，87.97％，89.78％沒有明顯減少(P>O.05)，同樣對照組、缺氧6 h、氧再灌注24和48 h的S期細胞分別為20.34％，9.02％，6.06％，5.79％較實驗組20.03％，9.01％，5.06％，4.93％沒有明顯增多(P>O.05). Pravastatin干預后，對照組、缺氧6 h、氧再灌注24和48 h的半乳糖苷酶活性陽性細胞分別為9.13％，12.55％，42.15％，53.48％