BmNPV DNA結合蛋白GP88對病毒復制和轉錄調控機制的研究.pdf

1、眾所周知，通過基因敲除的方法研究桿狀病毒基因的功能是一種很有效的手段，特別是探究基因在病毒感染周期中對病毒復制和基因轉錄調控的影響方面尤為突出。GP88蛋白是家蠶桿狀病毒(BmNPV)基因組中的一種DNA結合蛋白，被認為是一種病毒基因轉錄調控因子，然而，在病毒DNA復制、轉錄過程中GP88蛋白是否起著某種調節(jié)作用還未可知。在這項工作中，我們運用Red重組技術敲除了BmNPV的gp88基因，構建了gp88缺失型病毒gp88-ko-Bacm

2、id;再利用Bac-to-Bac技術構建了gp88補回型病毒gp88-re-Bacmid，再將三種病毒Bacmid（wtBacmid、gp88-ko-Bacmid和gp88-re-Bacmid）DNA轉染BmN細胞，經(jīng)過實驗分析發(fā)現(xiàn)，gp88缺失型病毒TCID5o為零，而gp88修復型病毒的TCID5o則與野生型基本相同(p＞0.05)，這說明gp88基因缺失會導致不能形成具有感染活性的病毒粒子。為了深入了解GP88的生物學功能，我們利

3、用熒光定量PCR技術分析了三種病毒Bacmid轉染細胞后病毒基因組DNA的復制情況以及病毒早期、晚期和極晚期基因的轉錄情況。結果顯示，缺失gp88基因后，病毒基因組DNA的復制水平較野生型和補回型病毒均顯著降低(p＜0.05);病毒早期基因lef-3、ie-1和dnapol，晚期基因vp39與極晚期基因p10的轉錄水平相比較修復型與野生型病毒而言均有顯著降低(p＜0.05)。WesternBlot檢測顯示gp88基因的缺失會導致LEF3

4、、VP39以及P10基本不表達，而野生型和gp88補回型病毒則檢測到上述三種蛋白表達。透射電鏡檢測結果也進一步證實了gp88基因缺失后，細胞內無成熟的病毒粒子形成，而gp88基因修復后，電鏡觀察的情況與野生型病毒相似，有大量成熟的病毒粒子產(chǎn)生。綜上研究結果表明:gp88基因的缺失會導致BmNPV基因組復制水平顯著降低;敲除gp88后會導致BmNPV各時期基因的轉錄水平顯著下降，同時也會導致病毒早期、晚期和極晚期蛋白表達水平顯著降低或不表