番茄生長素受體同源基因SITIR1的克隆與功能分析.pdf

1、生長素是一種重要的植物內源激素，由產生部位轉移到作用部位，并以極低的濃度影響植物細胞的分化、分裂、伸長、發(fā)育及植物整體形態(tài)的建立、生理生化活動等。生長素信號如何被植物接收并對植物生長發(fā)育的過程發(fā)揮調控作用，其中一個十分關鍵的因子就是生長素受體。因而，生長素受體一直是生長素信號轉導研究中的一大熱點。但由于過去很長時間內在生長素受體領域的研究一直停滯不前，所以極大地阻礙了生長素信號轉導途徑及作用機制的研究。近二十年的研究結果表明，TIRl(

2、transport inhibitor response I)編碼一個F-box蛋白，該蛋白與其他幾種蛋白在植物體內組裝成SCFTIRl蛋白復合體，SCFTIRl對生長素信號轉導反應是必需的，但是，對于TIR1基因的功能一直沒有得到確證。2005年，Dharmasiri和Kepinski等人的研究證明TIR1直接與生長素結合，并確定TIR1是擬南芥中生長素的受體，從而引起了科學界的廣泛關注。隨后對生長素受體同源基因家族成員的AFBl-A

3、FB3的研究表明，TIR1及其同源家族成員作為生長素受體在生長素介導的植物發(fā)育過程中發(fā)揮著重要的作用。
　　 番茄作為典型的躍變型果實，其生長、發(fā)育和成熟過程的表觀特征變化非常明顯，加之遺傳背景較為清楚，基因組小而且生長周期短，因而成為研究果實發(fā)育及成熟過程的重要模式材料。大量研究結果證實，生長素幾乎參與番茄生長和發(fā)育的各個方面。近年來，對生長素調控果實發(fā)育過程的研究報道明顯增多，但是至今沒有關于番茄生長素受體基因的分離及其參與

4、植物生長和果實發(fā)育的報道。所以，開展番茄生長素受體基因功能的研究將對深入闡明生長素在番茄發(fā)育過程的調控機理具有重要意義。
　　 為了研究SlTIR1的生物學功能，本研究開展了以下幾個方面的研究：
　　 (1)利用番茄EST序列數據庫中的信息，通過電子克隆技術和RACE技術克隆了番茄TIR1同源基因，命名為SlTIRl；生物信息學分析結果表明SlTIR1與AtTIRl的蛋白序列具有很高的同源性，其次分別與AtGRHl、At

5、AFB2、AtAFB3，一致性/相似性分別為77％/89％、66％/80％、59％/75％、60％/75％。對蛋白保守結構域的分析結果顯示，SlTIR1與AtTIRl都含有一個F-box結構域和六個亮氨酸富集重復(LRR)結構域。
　　 (2)采用半定量PCR方法，以番茄的根(root)、莖(stem)、葉(leave)、花(flower)、未成熟綠期果實(immature green)、成熟綠期果實(mature green)

6、、破色期果實(breaker)、紅熟期(ripe red)果實等不同組織為材料，對SlTIR1基因進行了組織表達分析，結果表明，SlTIR1在各種組織中都有表達，但在花中表達最強，根中表達最弱；為了進一步明確SlTIR1基因在花中的表達特征，以開花前2天、開花期和開花后4天的子房、雄蕊、花瓣、萼片為材料，采用定量PCR方法對其表達模式進行了分析，結果表明，SlTIR1在花蕾期到開花期的各種花的組成部分中都有表達。從花蕾期到開花期，萼片中

7、SlTIR1表達量升高，而雄蕊中SlTIR1表達量急劇下降。從開花期到開花后4天(果實開始形成)，子房和萼片中SlTIR1表達量都降低。由此推測，花期SlTIR1表達水平的變化可能與果實形成過程密切相關。
　　 (3)為了明確番茄SlTIR1蛋白的亞細胞定位，構建了CaMV35S: SlTIRl-GFP融合表達載體，經轉化煙草原生質體，激光共聚焦顯微鏡檢測結果顯示SlTIR1定位于細胞核中。
　　 (4)根據SlTIR1

8、基因cDNA序列及番茄基因組數據庫中的序列信息，克隆了SlTIR1基因啟動子序列，通過生物信息學方法預測了啟動子中可能的調控元件，利用相應的激素處理幼苗，用定量PCR方法檢測了SlTIRl基因在各種激素處理前后轉錄水平的變化。結果表明，Ethephon和ABA處理番茄幼苗2h，SlTIRl基因的表達下調；NAA和GA處理幼苗2h，SlTIR1的表達上升；結果表明，番茄幼苗中SlTIR1基因表達受NAA、GA的正調控，受Ethyphon、

9、ABA的負調控。
　　 (5)為了深入研究SlTIR1基因的功能，構建了SlTIR1基因超表達載體并轉化番茄，通過對SlTIR1超表達植株形態(tài)學特征分析結果表明，SlTIR1基因超表達導致番茄單性結實和葉片形態(tài)的改變；同時，SlTIR1超表達后改變了生長素應答基因的轉錄水平。生理學和分子生物學數據表明，SlTIR1基因在生長素信號轉導和番茄果實形成過程中起著正調控作用。本論文的研究結果為闡明果實單性結實的機制奠定了基礎。