雙價(jià)基因轉(zhuǎn)化石斛蘭的研究.pdf

1、石斛蘭軟腐病的致病菌是胡蘿卜軟腐歐文氏菌，且其致病機(jī)理與自身的群感效應(yīng)系統(tǒng)有關(guān)。蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis，Bt)的aiiA基因編碼的AiiA蛋白通過(guò)降解致病菌群感效應(yīng)系統(tǒng)中的信號(hào)分子來(lái)擾亂其群感效應(yīng)從而達(dá)到防治石斛蘭軟腐病的效果；抗菌肽具有廣譜抗性，對(duì)于細(xì)菌、真菌、病毒、原核生物及癌細(xì)胞都有一定毒性，甚至可以直接殺死某些微生物，所以克隆自棉鈴蟲(chóng)(Helicoverpa armigera)的hacD基因

2、其編碼的抗菌肽也可以作為防治石斛蘭軟腐病的策略之一。本論文擬通過(guò)對(duì)aiiA基因與抗菌肽hacD基因的成熟片段進(jìn)行原核表達(dá)，并分析這兩種蛋白的活性，然后將aiiA基因與抗菌肽hacD基因的成熟片段融合后，應(yīng)用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法將此融合基因轉(zhuǎn)入石斛蘭，以期獲得抗軟腐病的石斛蘭植株。
　　 本研究通過(guò)PCR方法克隆了aiiA基因(來(lái)自Bacillus thuringiensis)和抗菌肽hacD基因的成熟肽片段(來(lái)自Helicoverp

3、a armigera)，將這兩個(gè)基因融合，hacD基因融合到aiiA基因的下游端，并在兩個(gè)基因的融合處引入Factor Xa的酶切位點(diǎn)，將融合基因克隆到原核表達(dá)載體pQE-30上并轉(zhuǎn)化大腸桿菌M15，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，高效表達(dá)出了大小為34 kDa的融合蛋白。融合蛋白經(jīng)非變性純化、脫鹽濃縮后，測(cè)定了其生物活性。對(duì)融合蛋白進(jìn)行了活性分析，結(jié)果顯示只有經(jīng)Factor Xa酶切釋放出來(lái)抗菌肽能夠抑制標(biāo)準(zhǔn)抗菌肽活性測(cè)試菌E.coli K12D31

4、的生長(zhǎng)；對(duì)AiiA的活性進(jìn)行了測(cè)定，結(jié)果表明融合蛋白經(jīng)酶切后釋放出的AiiA蛋白及未經(jīng)酶切的融合蛋白均保持了降解AHLs分子的能力；除此之外，胡蘿卜侵染實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，經(jīng)融合蛋白處理過(guò)的胡蘿卜軟腐歐文氏菌能夠減緩軟腐病癥。
　　 將aiiA基因和抗菌肽hacD基因的成熟肽片段融合后，克隆進(jìn)包含有花椰菜花葉病毒35S(Cauliflower Mosaic Virus 35S promoter,CaMV 35S)啟動(dòng)子、胭脂堿合成酶基因的