rolB、rolC基因對轉Ri質粒三倍體毛白楊的轉化.pdf

1、Ri質粒上含有誘根基因即rol基因，將Ri質粒或單個或幾個rol基因組合導入植物體內均能提高植物的生根能力，但是某些植物在轉入rol基因后往往會使植株表現出一些不良的變異，如出現了植株矮化、葉面皺縮、節(jié)間縮短、分支能力增強等性狀，對植物的生長發(fā)育產生很大的影響。為減少rol基因對植物造成的不良變異，本文以劉興菊研究的轉Ri質粒30148菌株的三倍體毛白楊3個無性系為研究對象，通過對葉片再生體系和遺傳轉化條件的優(yōu)化，建立了高效離體再生系統(tǒng)

2、和遺傳轉化體系，并將ro/B、rolC誘根基因導入轉Ri質粒的三倍體毛白楊，對部分轉化再生植株進行了形態(tài)鑒定、PCR檢測和GUS組織化學染色檢測，并對轉化植株形態(tài)及生長變異和葉片解剖結構進行了初步研究，主要研究內容及結果如下： 1．進行了葉片外殖體高效再生系統(tǒng)的研究，篩選出轉Ri質粒的三倍體毛白楊葉片誘導不定芽的適宜培養(yǎng)基為：MS+6-BA1.0mg．L<'-1>+NAA0.05mg．L<'-1>，誘導不定根的適宜培養(yǎng)基為：MS

3、+NAA0.1mg．L<'-1>。并以此種誘導不定芽的適宜培養(yǎng)基，研究了暗培養(yǎng)對誘導葉片不定芽的影響，結果表明，暗培養(yǎng)5d對不定芽誘導是有利的。 2．通過卡那霉素(Km)敏感性試驗，確定了誘導葉片外殖體不定芽的Km臨界耐受濃度為30mg．L<'-1>。同時研究了頭孢噻肟鈉(CTX)對誘導轉Ri質粒的三倍體毛白楊葉片不定芽的影響和對農桿菌的抑菌效果，結果表明，CTX適宜的抑菌濃度為400 mg．L<'-1>。 3．對影響農

4、桿菌轉化效率的幾個主要因素進行研究發(fā)現，轉Ri質粒的三倍體毛白楊葉片外殖體適宜的侵菌時間是8min，侵染后共培養(yǎng)2d可獲得較好的轉化效果。 4．分別將含質粒pCMB-B：GUS和pPCV002-CaMVC的農桿菌與轉Ri質粒的三倍體毛白楊葉片共培養(yǎng)，通過在50mg．L<'-1>Km的培養(yǎng)基上篩選后，獲得了Km抗性植株，對部分抗性植株進行了PCR檢測，證明rolB、rolC基因已整合到轉Ri質粒三倍體毛白楊的基因組中，對部分PCR

5、檢測呈陽性的pCMB-B：GUS轉基因無性系進行組織化學染色分析表明，GuS基因主要在根尖、莖及葉脈維管束組織中特異表達。 5．進行了轉基因植株形態(tài)及生長變異的研究，發(fā)現與轉Ri質粒三倍體毛白楊相比，大部分轉rolB基因無性系植株矮化，葉面積增加，莖分支能力增強，節(jié)間距縮短，生根率及根數量降低，高生長量減少；大部分轉rolC基因無性系葉面由原來的皺縮變?yōu)槠秸梗o分支能力增強，節(jié)間距縮短明顯，生根率、根數量及高生長量增加。

6、 6．對轉基因植株葉片解剖結構及組織厚度進行了觀察，結果表明，轉基因無性系葉片解剖結構變化不明顯。大部分轉rolB基因無性系葉片厚度、葉肉厚度與其轉Ri質粒無性系對照相比差異顯著，柵欄組織和海綿組織厚度差異不顯著，50％的轉roIB基因無性系的表皮厚度與其轉Ri質粒無性系對照相比差異顯著。大部份轉rolC基因無性系葉片厚度、葉肉厚度與其轉Ri質粒無性系對照相比差異不顯著。轉Ri質粒不同無性系在轉rolC基因后，柵欄組織厚度變異程度不同，