0緒論動物胚胎工程精簡后

1、,動 物 胚 胎 工 程,,王 鋒 王子玉 南京農業(yè)大學動物科技學院 南京農業(yè)大學動物胚胎工程技術中心,緒 論,一 動物胚胎工程的研究概況二 動物胚胎工程的研究內容三 動物胚胎工程的研究意義四 中國胚胎工程研究備忘錄,一、動物胚胎工程的研究概況,,動物繁殖學 生物工程 繁殖技術 細胞工程

2、 動物胚胎工程,,,1. 動物胚胎工程概念,現(xiàn)代生物工程技術對國民經濟的持續(xù)發(fā)展具有舉足輕重的影響，因此，它越來越成為各國研究開發(fā)的重點和科技競爭的熱點。我國政府也把生物工程技術作為優(yōu)先研究和發(fā)展的領域，并取得了令人矚目的成就。,,生物工程包括基因工程、細胞工程、酶工程和發(fā)酵工程。胚胎工程是細胞工程中的分支。動物胚胎工程就是以胚胎為研究對象，為了加速繁育經濟動物，培育動物的優(yōu)良品種，或挽救

3、瀕危動物使用的一系列工程技術方法，一般來說包括胚胎移植、試管動物（體外受精）、胚胎冷凍、胚胎分割、胚胎干細胞、核移植（克?。┘夹g等。,,胚胎工程是生物技術的重要組成部分，它的研究和應用不僅推動了制藥、器官移植醫(yī)學等領域的變革，而且還加速了畜牧業(yè)生產的發(fā)展。以牛為例，20世紀80年代中期，主要發(fā)達國家（美國、加拿大、日本等）在不斷開展胚胎工程深入研究的同時，已開始產業(yè)化，加速了良種牛的繁育速度，優(yōu)化了牛群結構，使牛群生產水平大幅度提高，

4、推動了畜牧業(yè)及相關產業(yè)的快速發(fā)展。,,我國近十幾年來對胚胎工程的研究投入了較大的人力和物力，單項技術取得了長足發(fā)展，但產業(yè)化程度與發(fā)達國家相差甚遠。主要表現(xiàn)在我國奶類總產量占世界總產量的1％多一點，人均占有奶量為世界平均水平的1/15，不到發(fā)展中國家的1/5，僅為發(fā)達國家的1/25；中國成年母牛的年均產奶量只有1700kg，遠低于世界平均5000-6000kg的水平（2002年數據）。,,造成這么大的差距，除了奶牛數目不足外，最根本的原

5、因就是中國奶牛的品質不佳，產奶量低。長期以來，我國只采用冷凍精液人工授精技術進行牛群品質改良，由于世代間隔長，改良速度慢，制約了牛群生產水平的提高速度。,,為了加速我國奶牛品質的提高，促進我國奶牛業(yè)向著優(yōu)質、高產、高效方向發(fā)展，只有通過牛胚胎工程產業(yè)化。目前我國在胚胎移植改良牛、羊品種，體細胞克隆牛、羊等家畜的技術方面已經進入國際先進行列。,2. 胚胎工程各項技術之間的關系,胚胎工程是在研究胚胎移植的理論和技術的基礎上建立起來的，在此

6、基礎上又解決了哺乳動物體外受精的技術，繼而推動了胚胎分割、性別鑒定、體細胞克隆、胚胎干細胞培養(yǎng)等現(xiàn)代胚胎工程技術的建立和發(fā)展。,,體內受精和早期胚胎發(fā)育是學習本課的基礎。胚胎工程的許多技術，實際是在體外條件下，對動物自然受精和早期胚胎發(fā)育條件進行的模擬操作。因此，必須先了解哺乳動物受精和早期胚胎發(fā)育的規(guī)律。,,本門課在總體內容安排上也體現(xiàn)了胚胎工程的發(fā)展脈絡。首先對胚胎工程的理論基礎──哺乳動物的受精和早期胚胎發(fā)育的規(guī)律，進行了較深入

7、地講述，在此基礎上介紹了各項胚胎工程技術。,,目前，胚胎工程技術中應用最多的是胚胎移植技術，無論是轉基因胚胎還是克隆等獲得的胚胎，最后都必須經胚胎移植才能獲得后代，胚胎移植是胚胎工程的最后一道“工序”。因此，可以說它是胚胎工程技術的基礎；,,體外受精解決了體內胚來源不足的問題；胚胎冷凍技術使胚胎移植的推廣不再受時間和空間的限制；胚胎分割技術方法簡單，效率更高；胚胎干細胞的培養(yǎng)不僅是胚胎工程的重要成就之一，在基礎生物學、畜牧學、醫(yī)學

8、上都有重要的應用價值，是當前研究的熱門課題之一。,3. 胚胎工程在繁殖學中的地位,（1）繁殖 雄性 精子 受精卵（胚胎） 胎兒 雌性 卵子 仔畜,,,,,,（2）繁殖的重要性,種族延續(xù)動物生產中的關鍵性環(huán)節(jié)：肉、奶、蛋等

9、畜產品的獲得均需要經過繁殖環(huán)節(jié)來實現(xiàn)。,（3）動物繁殖學的定義及研究內容,是研究動物生殖活動及其調控規(guī)律和調控技術的科學，是加強畜禽品種改良，保證畜牧業(yè)快速發(fā)展的重要手段，是現(xiàn)代動物科學或畜牧科學中研究最活躍的學科之一。是動物生產中的一門基礎學科，是畜牧專業(yè)的專業(yè)基礎課，主要包括四大內容。,繁殖理論,包括性別分化、性發(fā)育、性行為、配子（精子、卵子）發(fā)生、受精、胚胎發(fā)育、妊娠、分娩等整個繁殖過程中的各種生殖現(xiàn)象及機理。,繁殖技術,同期

10、發(fā)情、超數排卵、人工授精胚胎移植、體外受精、胚胎冷凍胚胎分割、性別控制、動物克隆發(fā)情鑒定、妊娠診斷、生殖免疫助產技術、生殖疾病控制技術,母,公,排卵,精子,自然交配,人工授精,體外授精,發(fā)情鑒定,精液保存,精子獲能,IVM,顯微授精,精卵結合,胚胎,胚胎干細胞,胚胎分割,胚胎移植,胚胎克隆,嵌合體,轉基因,誘導發(fā)情,超數排卵,同期發(fā)情,妊娠,妊娠診斷,分娩,分娩控制,助產,難產,生殖免疫,免疫去勢,類固醇免疫,蛋白質免疫,基因免

11、疫,性別控制,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,分子技術,,繁殖管理 繁殖障礙及其防治,,二、動物胚胎工程的研究內容,胚胎移植胚胎分割胚胎冷凍體外受精胚胎干細胞技術轉基因技術動物克?。ê艘浦玻┬詣e控制嵌合體技術,1.授精與早期胚胎發(fā)育,受精與早期胚胎發(fā)育,,,,,,,,,胚胎移植,胚胎移植是指將一頭良種母畜配種后的早期胚胎取出，移植到另外一頭或數頭同種的、生理狀況相同

12、或相似的母畜生殖道的適當部位，使之繼續(xù)發(fā)育成新個體的過程。實際上是由產生良種胚胎的供體和養(yǎng)育胚胎的受體分工合作共同繁殖后代的技術。,胚胎移植技術,牛胚胎移植技術路線示意圖,,1890年，英國Walter Heape首次獲得兔受精卵移植成功。20世紀70年代中期，胚胎移植技術經不斷改進，才發(fā)展到實際應用階段。近30年來，許多國家都建立了牛胚胎移植專業(yè)性公司，每年移植幾十萬頭，平均每次由一頭供體采集得胚胎，可獲得2-9頭犢牛，繁殖效率

13、增加了幾十倍。,意義：　提高良種母畜的繁殖利用率，加快純繁速度；　加快品種的選育進程；　代替種畜直接進口；　拯救瀕危動物；　研究手段。,,胚胎移植產的后代,,體外受精技術,,哺乳動物的體外受精已有120多年的歷史，早在1878年，德國科學家Schenk就開始進行體外受精的嘗試。1959年，張明覺 世界第一批試管兔。1970年，Mukherjee和Cohen， 小鼠。1978年，Steptoe和Edwards，試管嬰兒。

14、1980年，英國 波爾格，試管牛犢。,顯微受精技術,,胚胎冷凍,胚胎的冷凍保存，是將胚胎貯存在－196℃超低溫下長期保存的方法。這是20世記70年代試驗成功的一項新技術，是胚胎移植技術的重大突破，使胚胎移植不受時間和地點的限制，從而擴大了胚胎移植技術的效率。胚胎冷凍保存技術也是長期保存優(yōu)良母牛基因最可靠的技術措施。胚胎的冷凍方法大體分為常規(guī)冷凍方法（慢速冷凍法）和玻璃化冷凍法兩種。1972年Whittingham等人首先對小鼠的胚

15、胎冷凍保存取得成功。,胚胎冷凍技術,通過對胚胎進行顯微操作，將一枚胚胎用顯微手術等方法分割成二分、四分甚至八分胚,經體內或體外培養(yǎng),然后移植入受體中,以得到同卵雙生或同卵多生后代的技術。胚胎分割是擴大胚胎來源的一條有效途徑，其理論依據是早期胚胎的每一個卵裂球都具有獨立發(fā)育成個體的全能性。,胚胎分割技術,在應用胚胎移植術擴大良種畜群時，結合采用卵分割法，就可以更充分地利用胚胎。1個胚胎可當2個或4個胚胎用，不僅可降低胚胎成本，還可加快家

16、畜的繁育速度。最早的胚胎分割是在家兔進行的。1968年，Mullar等將家兔的8細胞胚胎一分為二，移植給受體母兔后，出生了仔兔。Trounson和Moore（1974）分割綿羊胚胎，繁殖出同卵雙羔。,,,,,,性別控制指通過人為干預并按人們的愿望使雌性動物繁殖出所需性別后代的一種繁殖新技術。兩條途徑：精子分離和早期胚胎的性別鑒定。1989年Johnson利用流式細胞儀成功的分離了兔子的活的X和Y精子，用分離的精子授精并產下了后

17、代。,性別控制技術,早期性別鑒定技術路線,取樣,PCR 性別鑒定,,,,,,雄性,雌性,,奶牛胚胎,,肉牛胚胎,移植,,,移植,胚胎克隆是在胚胎分割基礎上發(fā)展起來的一項胚胎工程技術，能大量生產基本同質的后代。該項技術在美國已經進入商業(yè)化服務，克隆胚胎可以冷凍保存，凍胚解凍后可再克隆產出同質后代。我國在山羊（1991）、兔（1990、1991）、牛（1995、1996）均有研究報道，并獲得胚胎克隆或再可隆后代。 胚胎克隆技術不僅可以生

18、產大量優(yōu)質母畜的后代，而且可以與其它生物技術結合起來應用。如進行性別鑒別后胚胎的克隆、生產高表達轉基因動物和用于保護稀有、瀕危動物資源。,克隆技術,哺乳動物胚細胞核移植,哺乳動物體細胞核移植,綿羊Dolly，乳腺上皮細胞，Wilmut et al. (1997)； 世界上第一頭體細胞克隆動物。小鼠30余只，卵丘細胞，Wakayama et al.(1998)；采用直接注射法將卵丘細胞注射到去核卵母細胞質中，得到克隆和再克隆小鼠。,,,

19、克隆技術,去核,移核,,克隆技術,電融合,培養(yǎng),,多莉,克隆小鼠,貓,克隆狗與其”父母”,狗,豬,馬,騾子,轉基因動物就是用實驗室方法將人們需要的目的基因導入動物的受精卵，使外源基因與動物本身的基因整合在一起，并隨細胞的分裂而增殖，在動物體內得到表達，并能穩(wěn)定地遺傳給后代。,,轉基因技術,國外轉基因動物研究首創(chuàng)記錄,轉基因技術,轉基因技術的發(fā)展前景非常廣闊： 1. 通過基因的定位整合技術，來發(fā)現(xiàn)許多未知基因的功能和已知基因的新功能

20、； 2. 在動物的遺傳資源保存，動物的基因改良及發(fā)揮特別優(yōu)秀個體的生產性能等方面，都將起到重要作用； 3.動物乳腺生產藥用蛋白質，是轉基因動物研究另一個特別重要的目的之一。目前約有20余種基因已在家畜的乳腺中獲得高效表達，有的已開始臨床試驗，不久由動物轉基因技術生產的蛋白質藥物即將面世； 4.通過轉基因技術可以生產提供人類器官移植所需的轉基因豬。,(引自上海轉基因研究中心),1994年德國成功培育出轉入生長素的轉基因豬

21、，出現(xiàn)了壯如小牛的“超級豬”。,(引自上海轉基因研究中心),(引自上海轉基因研究中心),(引自上海轉基因研究中心),胚胎干細胞,胚胎干細胞（embryonic stem cells，ES細胞）主要來自囊胚的內細胞團、早期胚胎的種細胞或胎兒的原始生殖細胞。哺乳動物胚胎在囊胚期之前，其每一個卵裂球都具有多能性，在一定的條件下均可發(fā)育成一個完整的個體。 1981年，英國劍橋大學的Evans和Kaufman用囊胚內細胞團(ICM)建立小

22、鼠ES細胞系。 1991年Matsui利用小鼠PGCs獲得了ES細胞系。 1998年美國Thomson從人的體外受精囊胚中分離得到了ES細胞。同年約翰霍普金斯大學的Shamblott等從人的PGC細胞中分離得到人的全能性干細胞。,,,,干細胞研究大事件（黃禹錫事件）,,把患者體細胞移植到去核卵母細胞中形成重組胚，把重組胚體外培養(yǎng)到囊胚，然后從囊胚內分離出ES細胞，獲得的ES細胞使之定向分化為所需的特定細胞類型 (如神經細

23、胞、肌肉細胞和血細胞)，用于替代療法。這種核移植法的最終目的是用于干細胞治療，而非得到克隆個體，稱之為“治療型克隆”。,三、動物胚胎工程的研究意義,動物胚胎工程技術是動物生物技術的重要組成部分之一，動物胚胎工程技術在二十世紀后期發(fā)展極為迅速，近年來胚胎工程技術的應用效益最為顯著，也是21世紀世界經濟增長的重要支撐技術之一。,,現(xiàn)代動物胚胎工程的概念涵蓋所有對動物配子和胚胎進行工程化操作的技術方法，主要分為四大類技術體系：第一類是胚胎

24、移植相關技術，包括超數排卵與胚胎移植(multiple ovulation and embyo transfer，MOET)技術、胚胎體外生產技術（試管動物）、胚胎移植前性別鑒定技術與動物性別控制技術、卵母細胞與胚胎的冷凍保存技術；,,第二類為動物克隆技術，包括胚胎分割技術、細胞核移植技術和胚胎嵌合技術體系；體細胞克隆技術還不十分完善，應用也剛剛開始，由于克隆胚基因再程序化的不完全這一技術瓶頸的存在，單純的體細胞克隆產業(yè)化應用尚無從談

25、起，但細胞核移植克隆動物生產技術與其他胚胎工程技術的組裝配套仍顯示出了廣闊的前景和商業(yè)潛力。,,第三為轉基因動物技術；第四類為胚胎干細胞技術。其中胚胎干細胞技術的主要研究意義在于發(fā)育生物學基礎理論和人類醫(yī)學組織工程。前三類胚胎工程技術在動物生產領域有重要的實踐意義。,,人工授精、試管牛犢、冷凍胚胎、卵分割法等胚胎工程技術大大加快了畜牧業(yè)的發(fā)展速度，使得家畜優(yōu)良品種的生產商品化了。據報道，1987年世界上已經有家畜胚胎移植公司20

26、0多個，如美國已建立了從事牛胚胎移植、精子冷凍、受精卵分割等技術研究的格拉納達公司。這家公司已向澳大利亞、新西蘭、巴基斯坦、巴拉圭和中國等國出口胚胎移植術。該公司已發(fā)展成資產10億美元的企業(yè)。,,胚胎工程不僅蘊藏著巨大的經濟效益，同時對保護珍稀動物和挽救瀕臨滅絕的野生動物也發(fā)揮著重大作用。例如，英國倫敦動物學院和劍橋動物良種繁殖動物學會合作，把斑馬的胚胎移植到普通馬的子宮里，這匹普通馬生出了一批小斑馬。又如，中國科學院動物研究所的科研

27、人員研究大熊貓的體外受精取得了很大進展，這將給人工繁殖大熊貓帶來希望。,,總之，體外受精、胚胎移植、胚胎分割、胚胎干細胞的培養(yǎng)等胚胎工程技術，不僅廣泛應用在畜牧業(yè)生產中，而且與醫(yī)學、制藥業(yè)等的發(fā)展，以及人們的生活有著越來越密切的關系。,四、中國胚胎工程研究備忘錄,60年代：魚類、兩棲類的細胞核移植 我國著名科學家童第周教授，于1960年開展魚類及兩棲類細胞核移植研究。鯉鯽核移植魚已大面積繁殖推廣。,70-80年代：胚胎移植

28、 1973年中科院遺傳所率先開展哺乳動物胚胎移植，兔胚胎移植成功。 胚胎移植成功動物：綿羊（1974年，中科院遺傳所、內蒙古三北種羊場），奶牛（1978年，中科院遺傳所、上海牛奶公司第七牧場），山羊（1980年，西北農大），小鼠（1980年，中科院遺傳所），馬（1982年，西北大學），豬（陜西）。,70年代末-80年代初：胚胎冷凍 在含有冷凍保護劑的溶液里，將胚胎保存于-196℃的液氮中。

29、需要時，解凍胚胎并移植獲得后代。這項技術廣泛用于牛的繁殖。 胚胎冷凍移植成功動物：兔（1979年，中科院遺傳所），奶牛（1981年，中科院遺傳所、上海奶研所），綿羊（1982年，中農院畜牧所），山羊（1982年，西北農大）。,,80年代：嵌合動物 胚胎細胞嵌合：將兩個胚胎聚集在一起，形成一個具有兩品種胚胎的新胚胎，由此發(fā)育所得的動物，叫嵌合動物，其各種器官都可以由兩品種細胞組成。成功的動物包括：小鼠（1

30、982年，發(fā)育所），兔（1988年，發(fā)育所），山羊（1993年，西北農大）。 胚胎干細胞嵌合：胚胎干細胞是由胚胎內細胞團在體外培養(yǎng)下建立的細胞系。把胚胎干細胞注射到囊胚內，經移植獲得嵌合動物。1992年，北京大學培養(yǎng)成功小鼠。,,80年代：胚胎分割 胚胎分割移植成功的有：小鼠（1986年，西北農大），奶牛（1987年，中科院遺傳所、四川鳳凰山乳牛場），山羊（1987年，西北農大），綿羊（1987年，中農

31、院畜牧所），兔（1990年，西北大學、中科院發(fā)育所）。,,80年代末：體外受精 卵子和精子在體外完成受精過程后移植獲得的個體，叫"試管嬰兒"或"試管動物"。1986年，北京醫(yī)大獲得自體胚胎移植的試管嬰兒。1988年，湖南醫(yī)大獲得異體胚胎移植的嬰兒。 成功的動物有：小鼠（1987年，遺傳所），兔（1990年，西北農大），牛（1989年，內蒙古大學），綿羊（1989年，

32、內蒙古大學），山羊（1991年，西北農大）。,,90年代：細胞核移植 細胞核移植成功的動物包括：山羊（1990年，西北農大），兔（1991年，中科院發(fā)育所），牛（1995年，華南師大，廣西農大），豬（1995年，西北農大），小鼠（1996年，湖南醫(yī)大）。,,90年代：連續(xù)細胞核移植 1993年，中科院發(fā)育所獲得第二代核移植山羊。1992-1996年，西北農大得到第一代至第五代核移植山羊。1995年，西北農

33、大將滋養(yǎng)層細胞作為供體細胞，獲得山羊。,,專業(yè)選修課，2個學分，共36個學時，其中理論學習30個學時，實驗2個共6個學時。 時間從1-12周，每周連續(xù)上3學時（其中2次為實驗課）。 成績評定：期終考試70%+實驗20%+平時10% 。,本門課程安排,1.動物繁殖學 2.動物繁殖生物技術（桑潤滋） 3.動物胚胎工程（郭志勤） 4.動物細胞工程與實踐（李青旺）,參考資料,南京農業(yè)大學動物胚胎工

34、程中心簡介,動物胚胎工程技術中心成立于2001年，掛靠在動物科技學院及動物遺傳育種與繁殖學科點（博士點），經過五年的發(fā)展，目前本中心已成為江蘇省重要的動物胚胎工程研發(fā)機構之一，先后承擔農業(yè)部農業(yè)結構調整重大技術研究專項 、江蘇省農業(yè)三項工程等各級科研項目20余項以及10多項橫向委托項目。,,人員組成：中心現(xiàn)有研究人員5名，外聘教授2名，各類研究生20余名。聘任日本山口大學鈴木達行教授為本中心名譽教授，新疆畜牧科學院原院長、全國動物胚胎生

35、物技術專業(yè)委員會主任郭志勤研究員擔任本中心兼職博導。,,實驗室建設：建有動物克隆、基因工程與胚胎移植（江浦）3個實驗室，總面積約200m2。擁有NIKON顯微操作系統(tǒng)、CO2培養(yǎng)箱、胚胎冷凍儀、生物顯微鏡、細胞融合儀、低溫高速離心機、PCR儀、凝膠成像系統(tǒng)以及電泳儀等設備，固定資產近200萬元。研究方向：動物克隆、轉基因、胚胎干細胞、生物技術保種、肉羊新品種選育以及胚胎移植技術推廣等。,發(fā)展中的南京農業(yè)大學動物胚胎工程技術中心,,,發(fā)