肺表面活性物質相關蛋白C和A原核表達載體的構建、表達及純化.pdf

1、研究背景
　　 肺表面活性物質(pulmonarysurfactant，PS)是由磷脂和蛋白質組成的一種具有高度表面活性的復合物，磷脂含量為85％-90％，蛋白質含量為8％-10％。存在于被覆肺泡表面的液體中，其結合的特異性蛋白為肺表面活性物質相關蛋白，共有4種，小分子疏水性肺表面活性蛋白B與C，分子量分別為6-8KD和3-5KD，大分子親水性肺表面活性蛋白A與D，分子量分別為28-36KD及43KD。
　　 人類肺表面

2、活性物質相關蛋白C（surfactantassociatedproteinC，SP-C）基因全長2.4kb，定位于第8號染色體短臂，5個內含子和6個外顯子，僅表達于肺泡Ⅱ型上皮細胞。SP-C基因最初可編碼產生含191～197個氨基酸、分子量為21KD的蛋白質初級產物SP-C蛋白前體。非成熟的SP-C蛋白前體需經過多步復雜的酶解過程才能分化為成熟并具有生理活性的小分子疏水性蛋白SP-C，具有促進磷脂在肺泡表面形成穩(wěn)定的單分子層，從而降低肺

3、泡表面張力、防止呼氣末肺泡塌陷、增加肺順應性、促進肺間質液體回流及參與肺器官局部防御體系等重要的生理功能。
　　 肺表面活性物質相關蛋白A（surfactantassociatedproteinA，SP-A）SP-A基因定位于10號染色體長臂q21～q24，核苷酸長度約為4.5Kb，包含兩個功能基因SP-A1、SP-A2和一個假基因。SP-A由兩種基因編碼:SP-A1和SP-A2，94％的核苷酸序列和96％的氨基酸序列相同.SP

4、-A基因最初可編碼產生含248-263個氨基酸.SP-A單體是一種糖蛋白，相對分子量為26-38KD，由Ⅱ型肺泡上皮細胞和Clara細胞合成和分泌。天然的SP-A由6個SP-A組成并形成一個“花束狀”結構。其作用包括以下幾個方面①參與肺泡表面活性膜的形成和代謝，與小分子肺表面活性物質蛋白B協(xié)同，促進表面活性物質板層體轉化為管髓體結構，繼而參與小分子疏水性肺表面活性物質蛋白B與C擴展管髓體為磷脂單分子層的作用;②通過受體介導，增加肺泡Ⅱ型

5、上皮細胞攝取脂質，抑制磷脂分泌，穩(wěn)定細胞內外肺表面活性物質水平，保證肺泡肺表面活性物質含量適當;③肺表面活性蛋白A增加肺泡Ⅱ型上皮細胞抗氧化能力;④肺表面活性蛋白A與D參與細胞免疫，對免疫細胞（尤其是單核巨噬細胞、中性粒細胞）具有趨化和調理吞噬作用;⑤肺表面活性蛋白A與D調節(jié)炎性及過敏反應，抑制T細胞增生，減輕肺過敏性反應或其它毒性物質在肺部的變態(tài)反應。
　　 胎肺從24周開始有肺表面活性物質蛋白分泌，32-34周達到高峰，SP

6、-A是最先被發(fā)現(xiàn)且在肺泡Ⅱ型上皮細胞中表達最強烈、信號最豐富的蛋白，約占SP總量的50％，與肺成熟度密切相關。SP-A與新生兒呼吸窘迫綜合征(NRDS)、成人呼吸窘迫綜合征、肺炎、哮喘、肺泡蛋白沉積癥(PAP)、特發(fā)性肺間質纖維化(IPF)、結節(jié)病、肺腺癌、系統(tǒng)性硬化等的發(fā)病和轉歸密切相關。SFTPC基因表達異常可致SP-C蛋白含量、結構變化和功能喪失進而導致新生兒嚴重的肺間質性疾病、嬰幼兒肺間質性疾病如類肉瘤病、彌漫性肺部疾病及部分成

7、人家族性肺纖維化，最后導致呼吸衰竭，這些已經被實驗和臨床研究所證實。因此尋找一種簡便、高效的方法檢測SP的含量對于預測與之相關的疾病臨床意義重大。
　　 目前許多評估肺成熟的方法大部分是以PS為分析對象的。大體可分為生物化學方法和生物物理學方法兩類。生物化學方法是定量分析一種或幾種表面活性物質成分的絕對量或相對量，包括卵磷脂/鞘磷脂(L/S)測定、磷脂酰甘油(PG)測定、飽和卵磷脂測定等;生物物理學方法是通過評價羊水或痰液中肺表

8、面活性物質成分的肺表面活性或物理效應來判斷肺成熟度，包括泡沫振蕩實驗、熒光偏振評價FLM、分光光度計、LB計數等;卵磷脂/鞘磷脂(L/S)測定、磷脂酰甘油(PG)測定生物化學方法操作復雜，需時長，容易受羊水血性污染的影響，使用受到一定的限制。生物物理學方法除泡沫振蕩實驗（主觀性太強）外，其他均需要特定的儀器設備，且在羊水受到血液或陰道分泌物污染時，準確率差;由于以上方法的不同缺陷，故目前建立一種非常簡便、準確，可被大家廣泛接受并應用的肺

9、成熟度檢測方法，仍是探索的熱點。
　　 SP-A含量的檢測對于上述多種疾病的診斷和預后具有很大的價值。杜風蘭等研究臍血SP-A水平與羊水SP-A水平的相關性，證明臍血可以代替羊水SP-A中水平作為胎肺成熟度的標志，利用westernblot方法，得到斑點雜交結果后用凝膠圖象分析系統(tǒng)測定NC膜上各點的相對灰度值，根據標準蛋白相對灰度值曲線，求得待測標本SP-A的實際含量，尚無法達到精確測定的標準。YoshioKuroki等利用雙抗

10、體夾心ELISA檢測樣本中SP-A，檢測范圍10～1280ng。此后，以SP-A單克隆抗體為基礎的雙抗體夾心ELISA技術被廣泛應用于SP-A的檢測，在SP-A的研究中發(fā)揮了重要的作用。KojiKaneko等人通過檢測24h內新生兒臍帶血及外周血中SP-A含量預測新生兒呼吸窘迫綜合癥的發(fā)生，確定SP-A是預測胎兒肺成熟度的重要標志。對于肺表面活性物質蛋白SP-C來說，目前主要的檢測方法為通過基因檢測的方法了解其基因突變位點，從而確定診斷

11、。多數SFTPC基因突變患者存在其SP-C蛋白表達量異常，由于基因診斷價格昂貴，而且耗時較長，可通過檢測SP-C蛋白有無變化進行篩查，從而提高預測肺間質性疾病的效率。
　　 目前國內市場尚無自研的肺表面活性物質蛋白含量檢測試劑盒，而進口試劑盒價格昂貴，不宜推廣使用。故研制定量檢測肺表面活性物質試劑盒意義重大。而提取SP-A、SP-C蛋白是研制檢測試劑盒的關鍵一步，本實驗室曾采用maltosyl-agarose柱層析法從人肺支氣管

12、肺泡灌洗液(BALF)中提取出高純度、高活性、結構正常的SP-A，2個成人尸肺中提取的SP-A含量約40mg。但該方法步驟繁瑣，產量少，更重要是尸體肺來源困難，用這種方法提取蛋白作為試劑盒的標準品來源不現(xiàn)實。SP-C分子量小，體內含量比SP-A更低，提取更困難。故利用基因工程方法合成目的蛋白后，將其作為抗原免疫動物，同時作為制備試劑盒的標準品是最佳的選擇。
　　 本實驗室用人尸肺提取的SP-A蛋白作為抗原，免疫BABL/c小鼠，

13、提取脾細胞后與骨髓瘤細胞融合，經過篩選抗體后建立了SP-A單克隆細胞株，并能分泌高效價有活性的SP-A單克隆抗體，為研制SP-A檢測試劑盒做好了準備（但試劑盒的標準品來源仍有困難）。故本課題擬用原核生物大腸桿菌表達SPA和SPC目的蛋白，具體研究內容包括以下幾個步驟:RT-PCR獲取目的基因、T-A克隆、PET-28a/SP-C及PET-28a/SP-A重組質粒的構建、SP-C、SP-A重組蛋白的原核表達及純化、鑒定、目的蛋白的抗原性檢

14、測。
　　 第一步RT-PCR獲取目的基因
　　 目的:通過逆轉錄-聚合酶鏈反應獲取目的基因SFTPA，SFTPC。進行TA克隆，克隆PCR產物，提高PCR產物的連接、克隆效率。
　　 方法:提取肺組織總RNA后進行逆轉錄-聚合酶鏈反應，2％的瓊脂糖凝膠電泳檢測。利用PMD-18T載體反應試劑盒，連接純化的目的DNA與PMD18T載體，并轉入感受態(tài)細胞DH5α，在含有X-Gal、IPTG、Amp的L-瓊脂平板培養(yǎng)

15、基上培養(yǎng)，形成單菌落。計數白色、藍色菌落。
　　 結果:成功提取到肺組織總RNA，瓊脂糖凝膠電泳檢測可見28s和18s兩條條帶亮度清晰，紫外分光光度計分析A260/A280為1.923，獲得的目的基因2％瓊脂糖凝膠電泳結果與其分子量相符;經Amp抗性和藍白顯色篩選，見培養(yǎng)板上長出藍白斑比例約為16:1，總菌落數約32個。挑取白色單菌落接種擴增后提取質粒。經序列測定后，以BamHⅠ和HindⅢ雙酶切，回收并純化。
　　 結

16、論:通過逆轉錄-聚合酶鏈反應成功獲得SFTPA，SFTPC目的基因。通過TA克隆的方法，可以成功克隆PCR產物。
　　 第二步PET-28a/SP-A，PET-28a/SP-C原核表達載體的構建
　　 目的:構建PET-28a/SP-C，PET-28a/SP-A重組質粒。
　　 方法:將表達質粒PET-28a及目的基因SP-A、SP-C進行BamHⅠ和HindⅢ雙酶切，過夜連接，連接后的重組質粒轉化至大腸桿菌BL

17、-21感受態(tài)菌中，加入800μL無抗生素的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)2h，取50μL涂板(含Kana)后，37℃過夜培養(yǎng)。用無菌牙簽挑取單菌落于5mL含50μg/(1)Amp的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)6h，再行質粒提取與雙酶切鑒定，鑒定為陽性重組質粒送基因公司測序。
　　 結果:將重組質粒送至基因公司測序，與genebank上公布的人肺表面活性物質相關蛋白基因序列一致，重組質粒命名為PET-28a/SP-C、PET-28a/SP-A。結論

18、:將SP-C及SP-A基因成功克隆到表達質粒PET-28a中。
　　 第三步SP-C、SP-A的原核表達及純化、鑒定
　　 目的:利用重組質粒表達SP-C及SP-A目的基因，合成目的蛋白SP-C及SP-A
　　 方法:分別將質粒PET28a與pET28a-SP-A/C轉化至E.coliM15[pREP4]中，37℃培養(yǎng)過夜。次日以5％轉接于LB培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)2h后，取3ml菌液，測光吸收值A600;加入IP

19、TG誘導1～5h后，分別收集菌體。表達產物用12％聚丙烯酰胺凝膠電泳分析。利用Ni-NTASlurry(agrose)方法進行純化，取純化后的蛋白收集物進行westernblot鑒定。
　　 結果:westernblot結果顯示SP-C、SP-A重組蛋白均為單一印跡，無降解條帶。
　　 結論:PET-28a/SP-C、PET-28a/SP-A在BL21中得到可溶性表達，且目的蛋白在表達過程中無降解。成功構建了肺表面活性物

20、質相關蛋白C/A的原核表達載體，并表達了目的蛋白SP-C/SP-A。利用Ni-NTASlurry(agrose)方法進行純化得到的蛋白純度高。
　　 第四步:目的蛋白的抗原性檢測
　　 方法:將目的蛋白SP-A及SP-C分別與佐劑混合后免疫健康的清潔級BALB/c小鼠各8只。檢測陽性血清不同稀釋倍數的抗體效價。
　　 結果:陰性對照組、不同稀釋倍數組采用單因素方差分析，有顯著統(tǒng)計學差異(SP-C(∶)F=271.