SARAF蛋白對動脈粥樣硬化的作用及機制研究.pdf

1、目的：建立ApoE基因敲除大鼠（Apolipoprotein E-deficient Rats，ApoE-/-Rats）動脈粥樣硬化模型及培養(yǎng)大鼠巨噬細胞，探討鈣庫操作性Ca2+內(nèi)流調節(jié)因子（Store-Operated Calcium Entry Associated Regulatory Factor,SARAF）在動脈粥樣硬化中的作用及機制。
　　方法：
　　第一部分、建立ApoE基因敲除大鼠動脈粥樣硬化模型
　

2、　將8周齡ApoE基因敲除大鼠共16只，分為實驗組和對照組，予高脂飼料喂養(yǎng)12周。實驗組在干預的前4周予2004型Alzet滲透泵植入大鼠皮下，內(nèi)部填充血管緊張素Ⅱ（AngiotensinⅡ,AngⅡ）,濃度為25mg/ml，以0.25μl/hr的速率穩(wěn)定釋放28天。對照組僅予等量生理鹽水。檢測血壓、心率、體重，12周后麻醉取血并處死，檢測炎癥因子白細胞介素-1β（Interleukin-1β,IL-1β）、腫瘤壞死因子-α、（Tumo

3、r necrosis factor-α,TNF-α），血脂TC、TG、HDL、LDL；取心臟及主動脈組織制備病理切片，作HE、油紅O、Masson染色，評估動脈粥樣硬化斑塊情況；采用實時定量基因擴增熒光檢測系統(tǒng)（qPCR）以及蛋白免疫印跡法（western-blotting）檢測主動脈SARAF、TNF-α、IL-1β表達。
　　第二部分、SARAF蛋白對巨噬細胞炎癥因子的調節(jié)作用
　　將NR8383巨噬細胞分為對照組（Bl

4、ank），ox-LDL組，空病毒干擾組(NC+ox-LDL)，SARAF過表達慢病毒載體轉染組(SARAF+ ox-LDL)。分別以空載體慢病毒和過表達SARAF載體慢病毒，轉染 NC+ox-LDL組和SARAF+ox-LDL組各24h，ox-LDL（終濃度100μg/ml）干預ox-LDL組、NC+ox-LDL組和SARAF+ox-LDL組各24h，采用western blotting技術檢測各組SARAF、TNF-α、IL-1β表達

5、。
　　再將NR8383巨噬細胞分為對照組（Blank），ox-LDL組，空病毒載體干擾組(NC+ox-LDL)，si-SARAF慢病毒干擾載體組（si-SARAF+ox-LDL）。分別以空載體慢病毒和si-SARAF干擾載體慢病毒，轉染NC+ox-LDL組和si-SARAF+ox-LDL組各24h，ox-LDL（終濃度100μg/ml）干預ox-LDL組、NC+ox-LDL組和si-SARAF+ox-LDL組各24h，weste

6、rn blotting檢測SARAF、TNF-α、IL-1β表達。
　　結果：
　　1.成功建立ApoE基因敲除大鼠動脈粥樣硬化模型，大鼠主動脈根部粥樣斑塊明顯；
　　2.實驗組ApoE基因敲除大鼠的主動脈SARAF蛋白及炎癥因子TNF-α、IL-1β表達升高；
　　3.SARAF過表達組NR8383巨噬細胞炎癥因子IL-1β、TNF-α表達增加；
　　4.SARAF基因干擾組NR8383巨噬細胞IL-1β