miR-16-5p在乳腺癌組織中的表達及對細胞生長、侵襲和凋亡的影響.pdf

1、為了探究miR-16-5p在乳腺癌中的表達及作用，筆者進行以下幾個方面的研究:一、乳腺癌組織中miR-16-5p、HIF-1α、VEGF的表達及其與患者臨床病理學特征的關系;二、上調(diào)miR-16-5p的表達對乳腺癌細胞系MCF-7、MDA-MB-231細胞生物學行為的影響;三、miR-16-5p對HIF-1α、VEGF轉錄后調(diào)控的作用機制研究。
　　第一部分 乳腺癌組織中miR-16-5p、HIF-1α、VEGF的表達及其與患者臨

2、床病理學特征的關系
　　方法:
　　1.采集鄭州大學第一附屬醫(yī)院乳腺外科74例手術切除乳腺癌組織及相對應的癌旁正常乳腺組織標本。
　　2.采用Agilent miRNA芯片技術檢測3例乳腺癌組織及相對應的癌旁正常乳腺組織標本中miRNA的表達情況。
　　3.運用熒光定量PCR檢測74例樣本中miR-16-5p和HIF-1α、VEGF mRNA的表達。
　　4.采用Western Blot技術檢測HIF-1α

3、和VEGF的蛋白表達情況。
　　5.分析miR-16-5p、HIF-1α、VEGF mRNA的表達與乳腺癌患者性別、年齡、組織學分級、TNM分期和有無淋巴結轉移之間的關系。
　　6.采用SPSS21.0.軟件進行統(tǒng)計分析，檢驗水準a=0.05。
　　結果:
　　1.經(jīng)Agilent miRNA芯片檢測分析，在乳腺癌組織中共有86個miRNAs表達異常，其中46個上調(diào)，40個下調(diào)。miR-16-5p在乳腺非特殊型浸

4、潤性癌中呈高表達。
　　2.qRT-PCR結果顯示，miR-16-5p在乳腺癌組織中的表達較正常乳腺組織顯著降低，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);
　　3.qRT-PCR結果顯示，HIF-1α、VEGF在乳腺癌組織中的mRNA水平表達量均顯著高于癌旁正常組織，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　4.Western blot結果顯示，HIF-1α、VEGF在乳腺癌組織中的蛋白水平表達量均顯著高于癌旁正常組織，差

5、異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　5.乳腺癌組織中miR-16-5p以及HIF-1α與VEGF的mRNA表達水平與患者的組織學分級、TNM分期及淋巴結轉移密切相關（P均＜0.05）;
　　結論:
　　1.在乳腺癌組織中，miR-16-5p表達水平較正常乳腺組織顯著降低，提示其可能在乳腺癌中發(fā)揮抑癌基因的作用。
　　2.miR-16-5p可能參與乳腺癌的發(fā)生發(fā)展過程，且可能與HIF-1α和VEGF的表達密切相

6、關。
　　第二部分 上調(diào)miR-16-5p的表達對乳腺癌細胞系MCF-7、MDA-MB-231細胞生物學作用的影響
　　方法:
　　1.采用Real-time PCR檢測乳腺癌細胞中miR-16-5p在不同乳腺癌細胞株MCF-7，MDA-MB-231，MDA-MB-435，MDA-MB-468，T47D以及正常乳腺細胞MCF-10A中的表達。
　　2.慢病毒感染MCF-7、MDA-MB-231細胞，篩選得到穩(wěn)定表

7、達miR-16-5p的細胞株，采用實時定量PCR檢測慢病毒感染后MCF-7、MDA-MB-231細胞中miR-16-5p的表達。
　　3.本實驗分為三組:實驗組（重組miR-16-5p慢病毒感染細胞），空白組（未處理的MCF-7和MDA-MB-231細胞）和陰性對照組（miR-NC慢病毒感染細胞）。
　　4.本課題采用CCK-8法、平板克隆形成實驗對各組細胞增殖和生長能力進行檢測。
　　5.AnnexinⅤ-APC/P

8、I雙標記流式細胞術、Hoechst染色法對各組細胞的凋亡情況進行檢測。采用侵襲實驗對各組細胞的侵襲轉移能力進行檢測。
　　6.裸鼠移植瘤實驗檢測miR-16-5p過表達對乳腺癌MCF-7和MDA-MB-231細胞裸鼠移植瘤的影響，并采用免疫組織化學檢測HIF-1α和VEGF蛋白的表達。
　　結果:
　　1.miR-16-5p在MCF-7,MDA-MB-231,MDA-MB-435,MDA-MB-468,T47D乳腺癌細

9、胞株中mRNA水平較MCF-10A的表達均有所下降，且差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，其中以MCF-7和MDA-MB-231下降最為顯著。
　　2.成功構建含miR-16-5p序列的慢病毒載體，穩(wěn)定高表達組中LV1-miR-16-5p在MCF-7中的表達量約為空白細胞組的6.41倍，在MDA-MB-231中的表達量約為空白細胞組的4.56倍。
　　3.通過CCK-8法檢測，結果表明miR-16-5p組與空白對照組和陰性對照

10、組相比，吸光度減少顯著。平板克隆形成實驗結果表明miR-16-5p組細胞克隆形成數(shù)較無關對照組和空白對照組顯著降低，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　4.AnnexinⅤ-APC/PI雙標記流式細胞術和Hoechst染色檢測顯示重組miR-16-5p慢病毒感染后MCF-7和MDA-MB-231細胞的凋亡率較空白對照組與陰性對照組顯著升高。
　　5.侵襲實驗發(fā)現(xiàn)，MCF-7實驗組穿膜細胞數(shù)為（49.0±5.1）個，相比

11、于空白對照組和陰性對照組穿膜細胞數(shù)明顯減少，有顯著的統(tǒng)計學差異(P＜0.05)。MDA-MB-231實驗組穿膜細胞數(shù)為（42.0±7.1）個，與空白對照組和無關對照組相比顯著減少，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　6.裸鼠移植瘤實驗表明實驗組腫瘤組織體積和正常對照組相比明顯減少，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。瘤組織免疫組化結果顯示，實驗組Hif和VEGF表達較正常對照組和陰性對照組明顯減少。
　　結論:
　　

12、1.成功建立了過表達miR-16-5p的乳腺癌MCF-7、MDA-MB-231細胞株。
　　2.體外上調(diào)乳腺癌細胞中miR-16-5p表達可有效抑制腫瘤細胞的生長、降低其侵襲能力，促進細胞的凋亡。動物實驗表明miR-16-5p過表達能有效抑制裸鼠移植瘤生長。
　　第三部分 miR-16-5p對HIF-1α、VEGF轉錄后調(diào)控作用機制的初步研究
　　方法:
　　1.通過生物信息學分析預測miR-16-5p的下游靶基

13、因。
　　2.設計靶向HIF-1α和VEGF的siRNA序列，轉染至MCF-7、MDA-MB-231細胞。分為以下幾組:未轉染的MCF-7、MDA-MB-231細胞（Blank組）、miR-16-5p慢病毒感染的MCF-7、MDA-MB-231細胞（miR-16-5p組）、HIF-1αsiRNA干擾表達的MCF-7、MDA-MB-231細胞以及VEGF siRNA干擾表達的MCF-7、MDA-MB-231細胞。通過qRT-PCR、

14、Western blot檢測各組細胞Hif/VEGF mRNA和蛋白表達，CCK-8法檢測各組之間細胞增殖，AnnexinⅤ-APC/PI雙標記流式細胞技術檢測各組之間的凋亡情況，侵襲實驗檢測各組之間的侵襲能力。通過western blot的方法檢測不同HIF-1α和VEGF以及miR-16-5p表達對乳腺癌細胞增殖，凋亡以及侵襲等相關蛋白的影響。
　　3.構建表達載體pcDNA3.1-HIF-1α、pcDNA3.1-VEGF，通

15、過回復實驗分析miR-16-5p對HIF-1α和VEGF生物學活性的調(diào)控。
　　結果:
　　1.HIF-1α和VEGF是miR-16-5p的預測靶基因。
　　2.MiR-16-5p不改變HIF-1α和VEGF的轉錄水平，但顯著影響其蛋白的水平，但siRNA干擾后，其HIF-1α和VEGF mRNA和蛋白表達顯著下調(diào)。
　　3.HIF-1α和VEGF的過表達明顯恢復miR-16-5p過表達細胞系MCF-7和MDA-

16、MB-231中HIF-1α和VEGF蛋白的表達。
　　4.HIF-1α和VEGF過表達能夠明顯逆轉miR-16-5p過表達對乳腺癌細胞MCF-7和MDA-MB-231細胞的促凋亡情況。
　　5.HIF-1α和VEGF過表達后，乳腺癌細胞MCF-7和MDA-MB-231的侵襲能力顯著增高，且能夠明顯逆轉miR-16-5p過表達對乳腺癌侵襲能力的抑制作用。
　　6.miR-16-5p的過表達與HIF-1α和VEGF的沉默能

17、協(xié)同性降低細胞的侵襲能力，促進細胞的凋亡，同時轉染后，BAD，BAX，和cleaved caspase3的表達顯著上升，MMP-9，p-AKT以及HIF-1α的表達均顯著降低。
　　結論:
　　1.miR-16-5p通過HIF-1α和VEGF發(fā)揮抑制乳腺癌的作用。
　　2.操縱miR-16-5p可能成為未來乳腺癌潛在的分子治療靶點。
　　全文結論:
　　1.乳腺癌組織中，miR-16-5p表達水平較正常組織