線蟲神經元特異性表達體系的建立與應用.pdf

1、線蟲作為一種重要的模式生物,具有結構簡單,生命周期短,繁殖能力強等特點而被用于神經生物學研究。其神經系統(tǒng)結構簡單,可分為運動神經元、感覺神經元、中間神經元等幾大類。線蟲神經功能研究中,通常進行特異性表達或標記神經元以進行針對性的研究。然而,線蟲中能被特異性標記的神經元和標記方法都較少,且需要繁復的人力勞動進行載體構建。本研究以解決這些問題為基本出發(fā)點。
　　本研究將線蟲單神經元表達的啟動子構建成MultisiteGateway體系

2、的第一個入門克隆形式,以便于高效準確的進行表達克隆構建。在進行大片段DNA序列的BP反應時,效率不高,但經濟成本高昂。為解決這個問題,引進In-fusion技術,將神經元特異性表達的啟動子構建形成入門克隆庫。如此,單神經元特異性表達啟動子便可以與任意基因組合構建表達載體,實現(xiàn)了較強的通用性。通過連接破傷風桿菌神經毒素TeTx、線蟲基因、熒光蛋白等基因組成表達載體的方法,對這些啟動子進行了表達驗證,同時對標記相同神經元的啟動子進行了比較。

3、然而,線蟲中能被單啟動子驅動特異性表達標記的神經元數(shù)量有限,被證實不足20個。運用位點特異性重組酶Flp/Frt、Cre/LoxP系統(tǒng)結合Gateway技術可實現(xiàn)多啟動子重疊表達神經元的標記。為實現(xiàn)多順反子在線蟲相同組織同時表達,線蟲中第二種反式剪接的splicedleader(SL2)被應用了進來。SL2e連接熒光蛋白,對其介導的多順反子表達效果進行了激光掃描共聚焦成像分析。
　　建立的這套神經元特異性表達體系可便捷地應用于線蟲