加減薯蕷丸對血管性癡呆大鼠海馬神經重構干預的研究.pdf

1、[目的]神經重構是血管性癡呆（Vascular dememtia,VD）發(fā)生及維持的重要機制，包括神經元丟失、神經膠質增生、軸突及樹突重構、突觸聯(lián)系紊亂及變性等。本課題通過研究加減薯蕷丸對VD大鼠海馬神經細胞凋亡與炎癥的干預，探索加減薯蕷丸減少海馬椎體元丟失及預防神經重構的作用；研究加減薯蕷丸對VD大鼠海馬神經膠質細胞中少突膠質細胞及星型膠質細胞增生干預及促進神經纖維再生的作用，探索其對VD神經膠質及神經纖維重構的干預；研究加減薯蕷丸對

2、VD大鼠海馬神經突觸的保護并促進突觸重建作用，探索其增強神經突觸聯(lián)系，預防突觸重構的作用。從干預神經重構的三個方面的作用進一步探討加減薯蕷丸對 VD的治療及改善智能的機制。
　　[方法]選取SPF級SD雄性大鼠40只，分為假手術組、模型組與藥物組三組。模型組與藥物組采用改良雙血管阻斷法制備VD模型，假手術組除不阻斷雙側頸總動脈外余操作同手術組。手術一周后藥物組以加減薯蕷丸濃縮制劑（由湖北省中醫(yī)院制劑室制備，劑量按1ml/100g體

3、重）灌胃治療45天，另兩組以生理鹽水灌胃，劑量、療程同藥物組。記錄三組大鼠在術前、術后與取材前體重變化，觀察大鼠精神、飲食、進水等情況。以水迷宮行為學實驗（包括定位航行實驗與空間探索實驗）評定三組大鼠學習記憶能力。水迷宮實驗結束后處死大鼠，對大鼠海馬取材，取新鮮海馬組織以進行電鏡觀察及RT-PCR檢測；取灌注海馬組織以進行HE染色與免疫組化染色。HE染色重點觀察大鼠海馬CA1區(qū)組織改變，包括椎體細胞層、輻射層、腔隙層、及多形細胞層改變;

4、免疫組化測定海馬 CA1區(qū)Bax、Bcl-2與NF-κB以分析VD大鼠海馬神經細胞凋亡與炎癥調控，反應神經保護與預防神經重構；檢測Olig-2、GFAP以分析少突膠質細胞與星型膠質細胞增生情況以反映海馬神經膠質重構；檢測SYP、PSD-95、MAP-2分析海馬突觸蛋白改變以研究突觸生成、突觸破壞與重建;采用RT-PCR分析海馬組織GAP-43mRNA表達以進一步研究神經再生與突觸重建的基因調控；采用透射電鏡重點觀察突觸超微結構的改變。<

5、br>　　[結果]一般情況觀察：在改良2-VO手術結束后，手術組大鼠進食、進水明顯減少，精神差、活躍程度明顯低下、嗜睡等現(xiàn)象。一周后體重比假手術組明顯下降（F值：19.535，P：0.000），術后經過2周左右的康復及喂養(yǎng)，手術組快速恢復，在進食、飲水等方面明顯增多，經過45天的飼養(yǎng)，在取材當天稱重，三組體重已無差異（F值：0.010，P：0.990）。
　　水迷宮實驗中，各組逃避潛伏期及逃避距離在實驗最初兩天相互間沒有統(tǒng)計學差異

6、，第三天開始，假手術組逃避距離及逃避潛伏期與模型組相比下降較多，達到顯著性差異（P<0.05）。第四天藥物組逃避距離及逃避潛伏期下降較快，與假手術組接近，二者與模型組相比達到顯著性差異（P<0.05, P<0.05）。在空間搜索實驗中，與模型組相比，假手術組及藥物組跨越平臺次數(shù)均較模型組多，達到顯著性差異（P<0.01及P<0.05）、平臺所在象限游行時間及游行距離多，達到顯著性差異（P<0.05及P<0.01）。三組總游行距離及速度沒

7、有統(tǒng)計學差異。
　　HE染色觀察：假手術組海馬CA1區(qū)錐體細胞排列3-5層，層次分明，相鄰細胞排列整齊致密，細胞質均質紅染，胞核大而圓，核仁清晰。輻射層呈較規(guī)則的輻射狀排列，膠質細胞較少，可見呈圓形核的少突膠質細胞。分子層排列致密，細胞間腔隙較少。模型組海馬CA1區(qū)細胞數(shù)目減少，細胞排列紊亂稀疏，椎體細胞分1-3層，細胞形態(tài)不完整，胞漿內可見空泡，細胞核深染、固縮，呈三角形或不規(guī)則形，核仁不明顯，部分細胞核消失。輻射層明顯疏松，極

8、性紊亂，延續(xù)到分子層和腔隙層。腔隙層纖維錯亂，縫隙較多較大?？梢娔z質細胞增生。藥物組海馬CA1區(qū)神經元排列較為整齊，椎體細胞明顯增多，排列5-7層，結構相對正常。輻射層致密，排列較規(guī)整。分子層及腔隙層可見大量椎體細胞及膠質細胞增生。
　　RT-PCR測定GAP-43mRNA表達來看，假手術組表達最低，模型組較之明顯升高，達到極顯著性差異（P<0.01）。而藥物組進一步升高，與假手術組及模型組相比均達到統(tǒng)計學差異（P<0.01及P<

9、0.05）。
　　免疫組化結果：1.凋亡及炎癥指標：Bax表達：模型組最高，與藥物組及假手術組相比均達到極顯著性差異（P﹤0.01, P<0.01）；假手術組最低，與藥物組相比達到極顯著性差異（P﹤0.01）。Bcl-2：藥物組Bcl-2表達最高，與假手術組及模型組相比均達到極顯著性差異(P﹤0.01, P<0.01）；假手術組Bcl-2表達比模型組高，達到極顯著性差異（P﹤0.01）。NF-κB：藥物組和假手術組均明顯低于模型組

10、，達到極顯著性差異（P﹤0.01），藥物組高于假手術組，達到顯著性差異（P﹤0.05）。
　　2.神經膠質細胞增生指標：Olig-2表達:假手術組表達最多，藥物組次之，二者與模型組相比達到極顯著性差異（P﹤0.01, P<0.01）；藥物組與假手術組相比達到顯著性差異（P﹤0.05）。模型組表達最低。GFAP表達：假手術組最低，與另外兩組相比均有極顯著性差異(P﹤0.01, P<0.01）；藥物組次之，與模型組相比達到極顯著性差異

11、（P﹤0.01）；模型組表達最高。
　　3.突觸相關蛋白表達：MAP-2表達：藥物組及假手術組高于模型組，達到顯著性差異（P﹤0.01， P﹤0.05）。藥物組高于假手術組，達到極顯著性差異（P﹤0.01）；SYP表達：藥物組表達明顯高于模型組及假手術組，達到極顯著性差異（P﹤0.01, P<0.01）；假手術組也明顯高于模型組（P﹤0.01）；PSD-95表達：藥物組及假手術組明顯高于模型組，達到極顯著性差異（P﹤0.01, P

12、<0.01）；藥物組最高，與假手術組相比，也達到極顯著性差異（P﹤0.01）。
　　突觸的電鏡觀察：假手術組：突觸間隙清晰，突觸前后膜輪廓完整。突觸小泡較多，突觸曲面規(guī)則，突觸前后膜吻合良好，后膜可見明顯增厚。線粒體完整，內質網上核糖體較多。模型組：突觸間隙模糊，突觸前后膜腫脹，空化。難以區(qū)分突觸前后膜。突觸小泡減少，線粒體固縮，較少。內質網脫顆粒。藥物組：突觸前后膜結構完整。突觸間隙清晰可見，突觸小泡較多，線粒體結構完整，含量豐