整合素ανβ6在銅綠假單胞菌LPS誘導(dǎo)BEAs-2B細(xì)胞EMT中的作用研究.pdf

1、銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa，P.aeruginosa）是臨床常見的機(jī)會致病菌，具有復(fù)雜的耐藥機(jī)制，可引起嚴(yán)重的下呼吸道感染。近年來，由于泛耐藥菌株的流行，銅綠假單胞菌下呼吸道感染患者常出現(xiàn)抗感染療程延長，遷延不愈，甚至導(dǎo)致患者病死率增加。反復(fù)感染與氣道上皮的纖維化修復(fù)密切相關(guān)，后者可引起患者不可逆的肺功能下降及遠(yuǎn)期不良預(yù)后，因此，如何改善氣道纖維化重塑，對于銅綠假單胞菌下呼吸道感染的患者具有重要的臨床意義

2、。上皮細(xì)胞可經(jīng)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（Epithelial-mesenchymal transition，EMT）分化為纖維化病灶中的成纖維細(xì)胞，活化的成纖維細(xì)胞可繼續(xù)分化為肌成纖維細(xì)胞，并分泌過多基質(zhì)金屬蛋白酶來進(jìn)一步促進(jìn)纖維化進(jìn)程，因此，EMT是纖維化病灶中成纖維細(xì)胞的重要來源之一。假設(shè)，支氣管上皮細(xì)胞在銅綠假單胞菌感染時可能發(fā)生EMT轉(zhuǎn)化，從而引起氣道纖維化重塑。
　　整合素αvβ6是特異性表達(dá)于上皮細(xì)胞的細(xì)胞粘附分子，可以通過改變

3、轉(zhuǎn)化生長因子-β1(Transforming growth factor-β1，TGF-β1)前體構(gòu)象，可控地上調(diào)局部TGF-β1活性。研究發(fā)現(xiàn)整合素αvβ6可調(diào)控肺、腎纖維化及相關(guān)上皮細(xì)胞EMT轉(zhuǎn)化，這與其上調(diào)局部TGF-β1-Smad2/3信號通路相關(guān)，后者是纖維化的主要機(jī)制之一，因此猜想，整合素αvβ6可能通過調(diào)控TGF-β1-Smad2/3信號通路來參與銅綠假單胞菌相關(guān)的氣道纖維化重塑過程，而其中和性抗體可能抑制銅綠假單胞菌相關(guān)

4、的支氣管上皮細(xì)胞EMT轉(zhuǎn)化，從而改善氣道纖維化重塑。
　　本課題分為兩部分:1.以銅綠假單胞菌LPS作為干預(yù)手段，支氣管上皮細(xì)胞BEAS-2B為實驗對象，驗證EMT是否參與銅綠假單胞菌相關(guān)的氣道纖維化，并探究其相關(guān)信號通路;2.以整合素αvβ6中和性抗體為治療藥物，探討整合素αvβ6在BEAS-2B細(xì)胞EMT過程中的作用及其機(jī)制，明確其中和性抗體對此病理過程的治療作用，為改善銅綠假單胞菌感染相關(guān)的氣道纖維化重塑提供實驗依據(jù)。

5、>　　第一部分 銅綠假單胞菌LPS誘導(dǎo)人支氣管上皮BEAS-2B胞EMT研究
　　研究目的：
　　驗證EMT是否參與銅綠假單胞菌相關(guān)的氣道纖維化重塑，并探究其相關(guān)信號通路。
　　研究方法：
　　(1)以銅綠假單胞菌LPS（Lipopolysaccharide，LPS）2μg/ml誘導(dǎo)人支氣管上皮BEAS-2B細(xì)胞，建立體外EMT病理模型。按LPS作用時間不同，將人正常支氣管上皮BEAS-2B細(xì)胞分為:空白對照組(

6、Con)、LPS作用24小時組、LPS作用48小時組、LPS作用72小時組，應(yīng)用Western blot以及間接細(xì)胞免疫熒光法檢測上皮標(biāo)記蛋白E-鈣黏素(E-cadherin，E-Cad)、間質(zhì)標(biāo)記物波形蛋白(vim entin，Vi)表達(dá);倒置顯微鏡檢測細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化;(2) Western blot檢測肌成纖維細(xì)胞標(biāo)記物α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)表達(dá)水平;(3) ELISA法檢測細(xì)胞

7、培養(yǎng)液上清中MMP-2和MMP-9分泌濃度;(4)檢測細(xì)胞培養(yǎng)液上清中TGF-β1水平，Western blot檢測Smad2/3(T-Smad2/3)以及磷酸化Smad2/3(p-Smad2/3)的表達(dá)水平;
　　研究結(jié)果：
　　(1)銅綠假單胞菌LPS可誘導(dǎo)BEAS-2B細(xì)胞發(fā)生EMT轉(zhuǎn)化:以銅綠假單胞菌LPS2μg/ml分別作用24小時、48小時、72小時后，Western blot顯示，與空白對照組比較，隨LPS作用

8、時間延長，BEAS-2B細(xì)胞上皮標(biāo)記蛋白E-Cad表達(dá)顯著下調(diào)(p＜0.05)，而間質(zhì)標(biāo)記物Vi表達(dá)顯著增加(p＜0.05);間接細(xì)胞免疫熒光亦提示，與空白對照組比較，隨LPS作用時間延長，BEAS-2B細(xì)胞上皮標(biāo)記蛋白E-Cad表達(dá)逐漸下降，而間質(zhì)標(biāo)記物Vi表達(dá)逐漸增加;倒置顯微鏡觀察顯示，與空白對照組比較，LPS作用72小時組細(xì)胞形態(tài)由類鵝卵石樣上皮表型變?yōu)樗笮伍g質(zhì)樣外觀;(2) Western blot結(jié)果提示，與空白對照組比較，

9、LPS作用72小時后，肌成纖維細(xì)胞標(biāo)記物α-SMA表達(dá)顯著上調(diào)(p＜0.05);(3) ELISA提示，與空白對照組相比較，LPS作用72小時后，細(xì)胞培養(yǎng)液上清中MMP-2和MMP-9濃度顯著升高(p＜0.05);(4)Western blot提示，與空白對照組比較，LPS作用72小時后，BEAS-2B細(xì)胞Smad2/3磷酸化水平升高(p＜0.05); ELISA提示，與空白對照組比較，LPS作用72小時后，細(xì)胞培養(yǎng)液上清中TGF-β1

10、濃度顯著升高(p＜0.05)，TGF-β1-Smad2/3信號通路激活。
　　研究結(jié)論：
　　(1)銅綠假單胞菌LPS可以誘導(dǎo)人支氣管細(xì)胞BEAS-2B發(fā)生EMT;(2)伴隨EMT過程，BEAS-2B細(xì)胞可過度分泌MMP-2和MMP-9，且能進(jìn)一步分化為肌成纖維細(xì)胞;(3) TGF-β1-Smad2/3信號通路的激活是銅綠假單胞菌LPS誘導(dǎo)支氣管上皮細(xì)胞EMT的潛在機(jī)制。
　　第二部分 整合素αvβ6對銅綠假單胞菌LP

11、S誘導(dǎo)BEAS-2B細(xì)胞EMT的調(diào)控作用及其機(jī)制
　　研究目的：
　　探討整合素αvβ6在BEAS-2B細(xì)胞EMT過程中的作用及其機(jī)制，明確整合素αvβ6中和性抗體對BEAS-2B細(xì)胞EMT及其相關(guān)生物學(xué)行為的治療作用，為改善銅綠假單胞菌感染相關(guān)的氣道纖維化重塑提供干預(yù)選擇。
　　研究方法：
　　(1)銅綠假單胞菌LPS2μg/ml作用BEAS-2B細(xì)胞24小時、48小時、72小時，Western blot檢測整

12、合素αvβ6表達(dá);(2)將人支氣管上皮細(xì)胞BEAS-2B分為以下幾組:空白對照組、LPS組、LPS+整合素αvβ6中和性抗體10D5組、LP S+TGF-β1受體特異性拮抗劑SB431542組、整合素αvβ6中和性抗體10D5組，Western blot以及間接細(xì)胞免疫熒光法檢測上皮標(biāo)記蛋白E-Cad、間質(zhì)標(biāo)記物Vi;倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變;(3) Western blot檢測肌成纖維細(xì)胞標(biāo)記物α-SMA表達(dá)水平;ELISA法檢測

13、細(xì)胞培養(yǎng)上清液中MMP-2和MMP-9分泌濃度;(4)檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清液中TGF-β1分泌水平，Western blot檢測T-Smad2/3以及p-Smad2/3的表達(dá)水平;
　　研究結(jié)果：
　　(1) Western blot顯示，伴隨EMT過程，銅綠假單胞菌LPS可誘導(dǎo)BEAS-2B細(xì)胞整合素αvβ6表達(dá)顯著上調(diào)(p＜0.05);(2) Western blot檢測E-Cad和Vi蛋白表達(dá)，與空白對照組對比，LPS組B

14、EAS-2B細(xì)胞上皮標(biāo)記蛋白E-Cad表達(dá)顯著下調(diào)(p＜0.05)，而間質(zhì)標(biāo)記物Vi表達(dá)顯著增加(p＜0.05);整合素αvβ6中和性抗體10D5及TGF-β1受體特異性拮抗劑SB431542治療組可逆轉(zhuǎn)EMT標(biāo)記蛋白E-Cad及Vi的表達(dá)變化(p＜0.05);間接細(xì)胞免疫熒光提示，與空白對照組對比，銅綠假單胞菌LPS可導(dǎo)致BEAS-2B細(xì)胞E-Cad表達(dá)下降，而間質(zhì)標(biāo)記物Vi表達(dá)增加，整合素αvβ6中和性抗體10D5及TGF-β1受體

15、特異性拮抗劑SB431542治療組可逆轉(zhuǎn)此變化;倒置顯微鏡觀察顯示，伴隨EMT過程，BEAS-2B細(xì)胞形態(tài)由鵝卵石樣上皮細(xì)胞外觀形變?yōu)樗笮伍g質(zhì)樣，整合素αvβ6中和性抗體10D5及TGF-β1受體特異性拮抗劑SB431542治療可改善此變化;(3)Western blot提示，與空白對照組對比，銅綠假單胞菌LPS可誘導(dǎo)BEAS-2B細(xì)胞α-SMA表達(dá)顯著上調(diào)(p＜0.05)，整合素αvβ6中和性抗體10D5及SB431542治療組可逆轉(zhuǎn)

16、α-SMA的上調(diào)(p＜0.05); ELISA提示，與空白對照組相比，銅綠假單胞菌LPS可引起B(yǎng)EAS-2B細(xì)胞培養(yǎng)液上清中MMP-2和MMP-9濃度顯著升高(p＜0.05)，整合素αvβ6中和性抗體10D5及TGF-β1受體特異性拮抗劑SB431542治療組可改善MMP-2和MMP-9的過度分泌(p＜0.05);
　　(4) Western blot提示，銅綠假單胞菌LPS可導(dǎo)致BEAS-2B細(xì)胞Smad2/3磷酸化水平升高(p

17、＜0.05)，整合素αvβ6中和性抗體10D5及TGF-β1受體特異性拮抗劑SB431542治療組可改善此變化(p＜0.05); ELISA提示，銅綠假單胞菌LPS作用組細(xì)胞培養(yǎng)液上清中TGF-β1分泌濃度顯著升高(p＜0.05)，整合素αvβ6中和性抗體10D5治療組可逆轉(zhuǎn)活化TGF-β1的過度分泌(p＜0.05)，而TGF-β1受體特異性拮抗劑SB431542不影響TGF-β1的分泌水平。
　　研究結(jié)論：
　　1)銅綠假