FAM172A在大腸癌轉移的作用機制研究.pdf

1、大腸癌(Colorectal Cancer，CRC)作為常見的人類惡性腫瘤，全世界每年大約120萬新發(fā)病例，同時至少60萬患者死亡。轉移是影響大腸癌患者預后的重要原因，大多數(shù)伴有轉移的大腸癌患者不適合傳統(tǒng)治療方式。大腸癌轉移主要與個體基因突變有關，大腸癌中基因突變不超過50％，故可認定大腸癌的轉移尚有其它新的抑癌基因或癌基因在起作用。FAM172A是本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)的一個新基因，我們最近的研究結果證實:1）FAM172A在CRC相關

2、組織中表達下調，且顯著抑制人大腸癌LoVo細胞增殖和促進凋亡;2）轉錄因子STAT1在轉錄水平調控FAM172A表達，增強后者功能。綜上所述，我們推測:FAM172A基因是一個典型的抑癌基因，進一步研究其轉錄調控相關機制具有重要意義。基因表達調控除發(fā)生在轉錄水平，轉錄后調控也是關鍵環(huán)節(jié)，miRNAs是近年來發(fā)現(xiàn)參與轉錄后水平調控的重要因子。miRNAs是一種由內源基因編碼的、長度大概為22個核苷酸的非編碼單鏈小RNA分子。研究證實miR

3、NA異常表達與大腸癌轉移相關，如miR-21在大腸癌細胞中表達明顯增高，并通過抑制PDCD4表達促進腫瘤細胞的侵襲。我們前期工作中利用生物信息學預測發(fā)現(xiàn)miR-27a可能靶向結合FAM172A，故我們推測FAM172A功能可能在轉錄后水平受到miR-27a的調控。本課題擬在前期工作基礎上，在轉錄后水平進一步闡明FAM172A抑制大腸癌侵襲轉移的調控機制，為大腸癌的基因治療提供科學依據(jù)和實驗基礎。
　　目的:
　　1、明確FA

4、M172A對大腸癌細胞遷移和侵襲能力的影響;
　　2、生物信息學篩選和驗證調控FAM172A的重要miRNA;
　　3、明確大腸癌組織及細胞株中miR-27a表達水平及其相關臨床意義;
　　4、探討miR-27a靶向FAM172A對大腸癌細胞遷移和侵襲的影響及其機制;
　　方法:
　　1、構建FAM172A重組質粒，通過細胞劃痕及Transwell侵襲實驗分別觀察FAM172A對LoVo細胞遷移和侵襲的影響

5、;
　　2、生物信息學篩選靶向FAM172A的重要miRNA，Luciferase報告基因技術驗證兩者結合關系;
　　3、RT-qPCR檢測大腸癌細胞株及配對組織標本中miR-27a表達水平。
　　4、構建穩(wěn)定過表達miR-27a的LoVo細胞株;細胞劃痕及Transwell明確miR-27a調控FAM172A對大腸細胞遷移和侵襲影響;western blot檢測miR-27a調控FAM172A對侵襲轉移相關重要信號通

6、路分子的表達影響;
　　5、數(shù)據(jù)統(tǒng)計采用SPSS22.0軟件分析，以均數(shù)±標準誤表示。計量資料組間比較采用兩獨立樣本t檢驗，多組間比較采用方差分析。P＜0.05為有統(tǒng)計學差異。所有實驗均獨立進行三次，取平均值進行統(tǒng)計分析。
　　結果:
　　1、過表達FAM172A減弱了LoVo細胞運動速度，引起LoVo細胞侵襲數(shù)量的減少，干擾FAM172A表達則加快了LoVo細胞運動速度，增加了其侵襲數(shù)量;
　　2、FAM172

7、A3'UTR存在miR-27a結合位點且雙熒光報告基因證實轉染miR-27a能引起熒光素酶活性下降。
　　3、在大腸癌相關組織中miR-27a含量明顯高于正常癌旁組織，臨床病例資料分析顯示其表達水平與TNM分期、淋巴結轉移和遠處轉移與否呈正相關;miR-27a在各人大腸癌細胞株的表達均高于正常人大腸上皮細胞。
　　4、轉染miR-27a導致LoVo細胞遷移加快和侵襲數(shù)量明顯增加，干擾miR-27a表達則引起LoVo細胞遷移和

8、侵襲數(shù)量減少;穩(wěn)定過表達miR-27a的LoVo細胞在導入FAM172A過表達質粒后，LoVo細胞遷移減慢及侵襲細胞數(shù)量減少，且轉移相關重要信號通路分子MMP-2、MMP-9和NF-κB的蛋白表達降低。
　　結論:
　　1、FAM172A抑制大腸癌細胞的遷移和侵襲;
　　2、miR-27a靶向結合FAM172A;
　　3、miR-27a的表達變化對診斷和評估CRC患者病情具有一定的價值;
　　4、FAM17