RNAi慢病毒載體的構建及對急性T系白血病細胞CD59基因沉默效應的研究.pdf

1、目的：構建 RNAi- CD59慢病毒載體，研究其對急性T淋巴細胞白血病細胞株Jurkat CD59的沉默效應，運用體內(nèi)和體外實驗探討CD59特異性沉默對腫瘤細胞免疫逃逸的作用。
　　方法體外實驗:免疫熒光比較正常人T細胞和Jurkat細胞上的CD59表達情況；構建 CD59干擾序列（RNAi-CD59-A、RNAi-CD59-B、RNAi-CD59-C)以及錯義序列(RNAi-NC)融合綠色熒光蛋白，以慢病毒為載體轉(zhuǎn)染進入人急性

2、T系白血病Jurkat細胞株，陰性對照為RNAi-NC，空白對照組為未經(jīng)任何處理的正常培養(yǎng)的Jurkat細胞系；運用熒光顯微鏡和流式細胞儀檢測各組細胞的轉(zhuǎn)染效率； RT-PCR檢測各組CD59基因以及凋亡相關基因Bcl-2/Bax mRNA的表達；Western-blot檢測各組CD59蛋白以及凋亡相關蛋白Bcl-2、Bax、 Caspase-3、Survivin蛋白表達水平的變化；激光共聚焦觀察CD59分子的定位；ELISA檢測各組細

3、胞培養(yǎng)上清中IL-3、TNF-P的表達；CCK8檢測各組細胞增殖效率的改變；流式細胞儀觀察各組細胞凋亡水平的變化。
　　體內(nèi)實驗:24只BALB/c-nu雌性裸鼠隨機分為4組(PBS組、Jurkat組、RNAi-NC組、RNAi-CD59-A組），將培養(yǎng)篩選后的細胞系通過尾靜脈注射進入裸鼠體內(nèi)構建裸鼠轉(zhuǎn)移瘤模型，注射前后0周、1周、2周、3周、4周，監(jiān)測小鼠生長狀態(tài)、小鼠體質(zhì)量及外周血白細胞數(shù)量的變化；流式細胞檢測技術觀察小鼠外周

4、血及骨髓中淋巴細胞的凋亡情況；ELIS A檢測各組小鼠血液上清中IL-3、TNF-P的表達。
　　結(jié)果體外實驗：熒光顯微鏡和FCM觀察轉(zhuǎn)染效率在90.00%以上； RT-PCR結(jié)果顯示沉默組CD59、 Bcl-2 mRNA表達水平降低(P＜0.05)，Bax mRNA表達水平升高(P＜0.05); Western-blot結(jié)果顯示沉默組CD59、Bax、Survivin蛋白的表達量減少，Bcl-2, caspase-3蛋白的表達量

5、增多(P＜0.05);激光共聚焦觀察到CD59分子主要定位于細胞膜；ELIS A結(jié)果顯示沉默組IL-3表達水平降低，TNF-P的表達水平升高(P＜0.05)；CCK8結(jié)果顯示RNAi-CD59-A組的細胞增殖效率明顯降低(P＜0.05);流式細胞儀觀察到RNAi-CD59-A組的細胞凋亡率明顯升高(P＜0.05)。
　　體內(nèi)實驗：動物模型構建成功，與 PBS組相比，各模型組裸鼠體質(zhì)量均有一定的下降（P＜0.05)，其中沉默組裸鼠體

6、質(zhì)量下降不如RNAi-NC組和Jurkat細胞組明顯（P<0.05);與 PBS組相比，各模型組外周血白細胞數(shù)均有明顯的升高(P＜0.05)，其中與Jurkat細胞和RNAi-NC組相比，沉默組外周血白細胞計數(shù)減少（P＜0.05);流式細胞儀結(jié)果顯示沉默組外周血和骨髓細胞中的細胞凋亡率明顯高于未沉默組(P＜0.05)；ELIS A結(jié)果顯示小鼠血液上清中沉默組IL-3表達水平降低，TNF-P的表達水平升高(P＜0.05)。
　　結(jié)論