基于逆轉錄病毒載體的表達克隆法的建立.pdf

1、21世紀初，在人類基因組序列完成之后，對基因功能的研究顯得日益重要，發(fā)現(xiàn)基因的受體將對了解基因的功能和作用機理起到至關重要的作用。與目前常規(guī)應用的細胞模型和動物模型不同，本研究從尋找基因受體入手從而開啟研究新基因功能的大門。配體/受體可在體內(nèi)外相互作用，雖然配體/受體的親和力不同，但大多數(shù)情況下配體/受體反應可在體外通過標記配體或受體而檢測出來。
　　 本研究建立的高通量表達克隆系統(tǒng)（expression cloning sys

2、tem）是一種快速、靈敏、高通量的篩選系統(tǒng)，它可用于分離、篩選受體和膜結合配體，該系統(tǒng)是以高效表達的逆轉錄病毒載體為核心，以高通量的磁力篩選法（Magnetic Cell Sorter，MACS）和高精密度的流式細胞儀分選法（Fluorescence-Activated Cell Sorter，F(xiàn)ACS）相結合的獨特的篩選方法。主要依據(jù)是配體/受體的相互結合，然后通過磁力分離和流式細胞儀分選將陽性細胞從眾多的陰性細胞中分離出來，再從擴增

3、的陽性細胞中分離和鑒定受體基因。
　　 具體方法是將已知的配體經(jīng)Fc標記后作為誘餌，再與ProteinG標記的磁珠結合，磁珠的特點是非常微小，相當于一個病毒顆粒，當配體蛋白結合到宿主細胞表面表達的受體上時，該細胞將停留在磁場中，從而與非受體表達細胞分開。MACS的優(yōu)點是效率高，可同時操作上億細胞，如此大量的細胞是無法直接在分選型流式細胞儀上操作的，所以經(jīng)MACS篩選到的陽性細胞增殖后，再次用同一配體孵育，用更精確的流式細胞儀分選

4、，直至完全純化，受體基因?qū)⒂门c載體互補的引物，經(jīng)PCR方法克隆。
　　 利用該系統(tǒng)具有很好的靈敏度，可以從106個細胞中篩選出低至2個表達受體的陽性細胞。為驗證該系統(tǒng)的可行性，應用該系統(tǒng)在相應的cDNA文庫中篩選到了2個已知基因的細胞受體；應用配體B7-H2蛋白作為誘餌，從活化的人T淋巴細胞cDNA文庫中篩選到其受體ICOS（inducible CO-stimulator），最終，從純化的受體表達細胞中分離出受體基因；應用配體B