載體pAAVeG-sgRNa-供體DNA的構建及與CRISPR-Cas9共同介導的基因編輯.pdf

1、目的:
　　構建AAV表達載體pAAVeG-U6gRNA，并根據不同的受體細胞設計不同的基因編輯模型來驗證新構建載體與CRISPR/Cas9共同介導基因編輯的能力。
　　方法:
　　首先通過基因克隆的方法，將原始的真核表達載體phU6-gRNA改造成能夠同時插入gRNA與外源供體DNA的AAV表達載體pAAVeG-U6gRNA，完成后通過基因測序確定改造后的載體序列，并且利用AAV輔助包裝系統(tǒng)(AAV-DJ Helpe

2、r Free Bicistronic System)將其包裝成病毒顆粒后感染肌細胞，用以檢測包裝成的病毒顆粒是否有感染能力。其次，為了驗證構建的pAAVeG-U6gRNA載體基因編輯的功能，我們設計了三個基因編輯的模型，包括人HFF細胞Slug基因的刪除模型（pAAVeG-hSlug-g3-g4）、 Mdx模型鼠肌細胞DMD基因的糾正模型(pAAVeG-Mdx-g3-Donor4)以及Slugtag在鼠C2C12細胞Slug基因的插入模

3、型（pAAVeG-mSlugtag-gRNA2）。利用AAV輔助包裝系統(tǒng)在293T細胞系中將各個模型AAV載體包裝成AAV，然后與表達CRISPR/Cas9和RFP的腺病毒(AdR-Cas9)共同感染受體細胞，最終通過PCR、WesternBlot、藥物篩選及基因組測序等實驗技術驗證載體pAAVeG-U6gRNA基因編輯功能。
　　結果:
　　各模型AAV及AdR-Cas9感染的受體細胞帶有綠色熒光及紅色熒光，表明感染成功，

4、加入病毒液感染48小時后，用倒置熒光顯微鏡觀察，結果顯示各受體細胞的感染效率約為60％。PCR、基因測序及Western Blot結果顯示，載體pAAVeG-hSlug-g3-g4成功介導了人HFF細胞Slug基因的刪除;載體pAAVeG-Mdx-g3-Donor4成功介導了Mdx模型鼠肌細胞DMD基因的糾正;載體pAAVeG-mS lugtag-gRNA2成功介導Slugtag外源供體基因在鼠C2C12細胞Slug基因中的插入。