順鉑誘導HBV再激活的分子機制研究.pdf

1、據(jù)世界衛(wèi)生組織報道，全世界目前約有20億人曾感染過乙肝病毒，其中約有4億成為乙肝表面抗原陽性的慢性攜帶者，而其中的75％的慢性攜帶者是中國人；中國每年因乙肝病毒感染致死的近50萬人，居全球首位。在我國，乙型肝炎病毒感染是誘發(fā)慢性肝炎，肝硬化和肝癌的重要危險因子。據(jù)統(tǒng)計，HBV再激活現(xiàn)象在無癥狀攜帶者和慢性乙肝患者中極少發(fā)生，但如果接受免疫抑制劑或或化療藥物治療時，會有一定幾率活化處于靜息狀態(tài)或是低復制狀態(tài)的乙肝病毒.大量瞬時活化的乙肝病

2、毒會誘發(fā)患者急性肝炎、急性肝衰竭甚至爆發(fā)性肝衰竭，使化療中斷，耽誤腫瘤患者的正常治療和預后，嚴重時可能危及患者生命。2011年，惡性腫瘤上升為人類死亡病因的第3位，其發(fā)病率和致死人數(shù)逐年上升。2011年，臨床統(tǒng)計HBV再激活的發(fā)病率為14%-66%， HBV再激活已經(jīng)成為嚴重威脅中國人健康的重要公共衛(wèi)生問題。
　　順鉑等化療藥物可以誘導 HBV再激活的現(xiàn)象已被國內(nèi)外多項臨床試驗證實，但是其誘導乙肝病毒復制再激活的分子機制至今尚不清

3、楚。目前解釋該現(xiàn)象的機制有兩種：第一種，化療藥物如順鉑具有很強的免疫抑制能力，通過抑制機體的免疫系統(tǒng)，使乙肝病毒免疫逃逸，乙肝病毒大量復制誘發(fā)HBV再激活。大多數(shù)學者認同這一機制。第二種，化療藥物順鉑可以直接促進乙肝病毒復制。目前國內(nèi)外關(guān)于順鉑直接促進HBV再激活以及相關(guān)分子機制的研究報道還是空白，本課題設(shè)計就是針對這一空白，研究探討順鉑直接促進HBV復制的相關(guān)的分子通路。
　　我們首先在體外成功構(gòu)建了環(huán)化自連的 HBV DNA(

4、circμlarized HBV DNA)并證實：無論在體內(nèi)還是體外，環(huán)化的HBV DNA的感染效率和復制水平均明顯優(yōu)于線性的HBV DNA(P<0.05)。使用環(huán)化的HBV DNA構(gòu)建的HBV水動力小鼠模型，并使用回交傳代法提高已有的C57 HBV轉(zhuǎn)基因小鼠的遺傳穩(wěn)定性，為下一步的實驗研究提供 HBV高效復制的動物模型。其次選用乙肝病毒穩(wěn)定表達的C57 HBV轉(zhuǎn)基因小鼠模型和前期構(gòu)建的HBV水動力小鼠模型，通過ELISA、REAL-T

5、IME PCR、Western-blot、Southern-blot、IHC和CHIP等實驗進行HBV再激活的體內(nèi)驗證實驗，檢測順鉑是否可以在體內(nèi)誘導HBV再激活。實驗研究順鉑誘導HBV再激活的分子機制：首先，篩選與HBV再激活相關(guān)的HBV啟動子和肝富集轉(zhuǎn)錄因子；其次，選取其中代表性的轉(zhuǎn)錄因子PGC-1α和HNF-4α進行體內(nèi)外驗證；通過CHIP等實驗證明PGC-1α、HNF-4α在順鉑誘導HBV復制過程中發(fā)揮重要作用；進一步構(gòu)建PGC

6、-1α和HNF-4α的siRNA，體內(nèi)外反向驗證PGC-1α和HNF-4α是否為順鉑誘導 HBV再激活的關(guān)鍵因子；同時通過 ELISA、REAL-TIME PCR、Western-blot等實驗篩選內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激相關(guān)因子，探討內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激與HBV再激活的相關(guān)性及其關(guān)鍵因子。實驗證實順鉑一方面可以通過直接上調(diào)HBV復制相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子PGC-1α和HNF-4α的表達，增強HBV核心啟動子活性，繼而在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)HBV的復制；另一方面可以引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應

7、激，UPR（未折疊蛋白反應）誘發(fā)PGC-1α表達上調(diào)，間接上調(diào)HBV復制。
　　結(jié)論：化療藥物順鉑可以在體內(nèi)外直接增強HBV復制與轉(zhuǎn)錄從而誘導HBV再激活。其分子通路可能有兩條：1. PGC-1α和HNF-4α通路，肝富集轉(zhuǎn)錄因子 PGC-1α和 HNF-4α作為共激活因子，可以共同結(jié)合于 HBV DNA增強子Ⅰ和增強子Ⅱ上，順鉑可以直接上調(diào)肝富集轉(zhuǎn)錄因子 PGC-1α和 HNF-4α的表達，直接增強乙肝病毒的復制，引起HBV再激