蘇云金芽胞桿菌幾丁質酶基因調控元件的鑒定和功能分析.pdf

1、南開大學博士學位論文蘇云金芽胞桿菌幾丁質酶基因調控元件的鑒定和功能分析姓名：謝池楚申請學位級別：博士專業(yè)：微生物學指導教師：陳月華2012-05摘要的大腸桿菌和B t 7 5 中都檢測不出任何伊半乳糖苷酶活性。將B t 7 5 菌株c h i A 、c M B 基因調控區(qū)域連入載體p C B ，獲得的重組質粒電轉化入原始菌株B t 7 5 ，得到的轉化子中c h i A 、c h i B 基因啟動子的誘導表達特性與原始菌株中幾丁質酶的誘

2、導合成特性一致。證明利用自行構建的啟動子探測型載體p C B ，完全可以開展本研究計劃的后續(xù)所有工作。通過對c h i A 調控序列的一系列缺失突變對酶活力影響的分析，發(fā)現調控序列從5 ’端缺失到．1 1 6b p 處或從3 ’端缺失到．4 2b p 處時啟動子仍然保持明顯的活性，更多缺失卻導致啟動子活性喪失，且只含．1 1 6 至．4 2 b p 的片段照常啟動基因的表達，證實c h i A 結構基因A T G 上游．1 1 6 至．

3、4 2 b p 位點之間長7 5b p 的序列是c h i A 基因的核心啟動子，．1 1 6b p 處的所有上游序列和．2 1 b p 處的全部下游序列對于c h i A 基因的表達和調控是非必須的，實驗結果與軟件預測的啟動子不吻合。研究發(fā)現和證實在核心啟動予下游、．2 0 b p 處上游附近存在一個應答幾丁質誘導的負調控位點，缺失或破壞這個位點導致c h i A 啟動子由誘導型表達轉變?yōu)榻M成型表達。另外，通過5 ' R A

4、C E 技術，證實在c h i A 基因核心啟動子內，結構基因A T G 上游．4 6 b p 處的“A “ 堿基是c h i A 基因的轉錄起始位點，由此確定c h i A 基因啟動子的．3 5 區(qū)和．1 0 區(qū)分別為“T T A C A A ”和“T A T C A T ”。通過對c h i B 調控序列的一系列缺失突變對酶活力影響的分析，結果顯示調控序列從5 ，端缺失至．3 2 4b p 處和從3 ’缺失至．4 lb p 處時對啟

5、動子的活性和誘導表達特性沒有任何影響。證明這些序列對于c h i B 基因的表達是非必須的。從5 ’端缺失至．2 3 2b p 處或從3 ’端缺失至．1 2 1b p 處時啟動子活性降低，但仍然保持明顯的活性，在此基礎上繼續(xù)缺失導致啟動子活性完全喪失。而只含- 2 3 2 至- 1 2 1b p的片段仍然保持一定的啟動子活性。由此證實c h i B 結構基因A T G 上游- 2 3 2 至．1 2 1b p 位點之間的序列為基因的核心

6、啟動子，與c h i A 不同，其上游及下游序列對啟動子的活性具有一定影響。同時證實c h i B 基因轉錄起始位點為結構基因A T G 上游．1 3 2b p 處的“C ”堿基，c h i B 基因啟動子的一3 5 區(qū)和．1 0 區(qū)序列分別為“T T T A C A ”和“T A C G A T ”。缺失分析還證明在c h i B 核心啟動子下游、．9 7b p 處上游附近存在一個應答幾丁質誘導的負調控位點( d r e ) ，該位點