造血調控分子PPP2Cβ參與紅系分化及EDAG在白血病發(fā)生中的作用研究.pdf

1、紅細胞的生成受到多層次、多水平的調控，其中轉錄因子在紅細胞生成過程中發(fā)揮重要的調控作用。GATA1是目前研究最為深入的紅系轉錄調控因子。GATA1一方面可通過翻譯后水平修飾如乙酰化、磷酸化等，進而調控其自身轉錄活性，另一方面還可與其它多種轉錄因子形成動態(tài)復合體，對下游基因進行選擇性調控，進而參與紅系分化。本研究主要圍繞GATA1的兩個相互作用蛋白PPP2Cβ與EDAG展開研究，揭示了PPP2Cβ與GATA1相互作用并調控紅系分化的新功能

2、，并探討了EDAG在BCR-ABL及MLL-AF9誘導的白血病中的作用。本研究分為以下兩部分：
　　第一部分: PPP2Cβ與GATA1相互作用促進紅系分化的研究
　　我們實驗室前期利用酵母雙雜交構建了造血干細胞（HSC）轉錄因子相互作用網(wǎng)絡，在該網(wǎng)絡中，蛋白磷酸酶2A的催化亞基β（PPP2Cβ）是GATA1新的相互作用蛋白，提示PPP2Cβ很可能調控造血分化。本部分我們首先利用促紅細胞生成素(Erythropoietin，

3、EPO)誘導臍血CD34+細胞向紅系分化，檢測了PPP2Cβ在分化過程中的表達，發(fā)現(xiàn)無論是在mRNA水平還是蛋白水平PPP2Cβ都發(fā)生明顯上調，而在分化晚期恢復正常水平，表明PPP2Cβ很可能在紅系早期分化過程中發(fā)揮重要功能。
　　進一步我們構建了PPP2Cβ帶Flag標簽的表達載體，利用免疫共沉淀實驗證實GATA1和PPP2Cβ存在相互作用，并確定了PPP2Cβ結合在GATA1的N端鋅指結構。利用雙熒光素酶報告基因實驗證明，PP

4、P2Cβ能增強GATA1的轉錄調控活性且能促進GATA1下游靶基因的轉錄。進一步利用慢病毒表達系統(tǒng)，構建過表達PPP2Cβ的K562細胞穩(wěn)定株，發(fā)現(xiàn)PPP2Cβ過表達可促使K562細胞自發(fā)向紅系分化。這些結果表明PPP2Cβ可調控GATA1活性，是一種新的紅系分化調控分子。
　　第二部分:EDAG在白血病發(fā)生中的作用研究
　　紅系分化相關基因（Erythroid Differentiation Associated Gene

5、，EDAG）是我們實驗室率先分離克隆的新基因，特異表達于造血組織，參與調控造血細胞的增殖、分化與HSC的譜系分化平衡。我們前期研究發(fā)現(xiàn)EDAG可與GATA1相互作用，通過募集p300增強GATA1乙酰化水平及轉錄調控活性，三者形成動態(tài)復合體，選擇性激活紅系分化相關基因，進而促進紅系分化。同時，我們也發(fā)現(xiàn)EDAG除了促進紅系分化外，還可能與白血病的發(fā)生有關。本部分我們探討了EDAG在BCR-ABL誘發(fā)的CML（慢性髓系白血病）及MLL-A

6、F9誘發(fā)的AML（急性粒細胞白血?。┌l(fā)生中的作用。
　　我們首先對BCR-ABL逆轉錄病毒進行了包裝，獲得高滴度病毒，并制備了BCR-ABL誘發(fā)的CML小鼠模型。對BCR-ABL感染的臍血CD34+細胞進行檢測發(fā)現(xiàn)EDAG表達顯著上調。進一步將BCR-ABL病毒感染EDAG基因敲除小鼠和正常小鼠的骨髓細胞，進行骨髓移植。結果顯示敲低EDAG可降低BCR-ABL誘發(fā)的CML發(fā)病率，表現(xiàn)為移植EDAG敲除小鼠骨髓細胞的受體小鼠發(fā)病時間

7、明顯晚于對照小鼠，外周血白細胞數(shù)目顯著低于對照組，這些結果表明 EDAG在BCR-ABL誘發(fā)的CML發(fā)病過程中發(fā)揮重要作用。
　　此外，我們利用MLL-AF9轉基因小鼠評價了EDAG敲除在AML細胞浸潤中的作用。在發(fā)病的MLL-AF9小鼠骨髓及脾臟中，EDAG表達顯著降低。進一步將發(fā)病的MLL-AF9轉基因小鼠脾細胞移植到EDAG基因敲除小鼠和野生型小鼠體內，研究造血微環(huán)境對白血病細胞的影響，結果表明兩組小鼠在血象各項指標中和外周