Survivin蛋白在病毒性心肌炎中的表達及其抗凋亡作用.pdf

1、目的:觀察凋亡抑制因子生存素（survivin）在病毒感染不同時間點心肌細胞中的表達規(guī)律，并初步探討survivin在病毒性心肌炎（viral myocarditis，VCM）中作用及其可能機制。
　　方法:體外培養(yǎng)新生Sprague Dawley(SD)大鼠乳鼠原代心肌細胞，并予柯薩奇病毒B3(coxsachievirus B3，CVB3)感染原代心肌細胞，建立病毒性心肌炎細胞模型，觀察感染后心肌細胞的病變、搏動情況改變，并用乳

2、酸脫氫酶(lactatedehydrogenase，LDH)細胞毒性實驗評估心肌細胞損傷程度，運用熒光定量PCR(RT-PCR)擴增出CVB3的特異性條帶。復制VCM細胞模型，在CVB3感染心肌細胞0h、12h、24h、36h、48h、60h后，顯微鏡下觀察心肌細胞形態(tài)、搏動變化及CPE形成情況，通過RT-PCR和蛋白免疫印跡法（Western Blot，WB）兩種方式，檢測感染病毒不同時間對細胞survivin表達的影響，應用Anne

3、xinⅤ-FITC/PI雙染色法流式細胞儀檢測細胞凋亡情況，WB技術檢測cleaved-caspase-3蛋白表達量，對survivin表達量與細胞凋亡率進行相關性分析。通過構建survivin基因過表達腺病毒轉染心肌細胞驗證survivin在病毒性心肌炎中作用，將原代心肌細胞分為3組:正常對照組（未進行病毒轉染），空病毒組（只攜帶GFP，不能過表達survivin），腺病毒組(既攜帶GFP，又能過表達survivin)，以正常細胞組作

4、為對照，檢測survivin過表達腺病毒轉染對原代心肌細胞產生的影響及病毒轉染效果;將細胞分為3組:感染對照組（僅感染CVB3病毒），空病毒組（只攜帶GFP，不能過表達survivin），腺病毒組（既攜帶GFP，又能過表達survivin），于細胞轉染后第3天，將CVB3病毒感染細胞60h，以感染細胞組作為對照，觀察各組心肌細胞形態(tài)、搏動變化及CPE形成情況，AnnexinⅤ-FITC/PI雙染色法流式細胞儀檢測細胞凋亡情況，WB技術檢

5、測蛋白cleaved-caspase-3蛋白表達量，探討surivin過表達后對細胞凋亡的影響。
　　結果:1.原代心肌細胞培養(yǎng)48h后可見心肌細胞呈圓形、梭形或者多角形，邊界清晰，偽足明顯，胞質及胞核亦清晰可見，呈自發(fā)性節(jié)律性搏動，在感染CVB3后，心肌細胞逐漸出現(xiàn)了細胞病變，感染48h心肌細胞開始出現(xiàn)團縮變圓，搏動減弱、不規(guī)則，至60h時大部分細胞脫壁、溶解，搏動停止。感染CVB3病毒后心肌細胞毒性率較對照組顯著增高，RT-P

6、CR在感染組心肌細胞中擴增出了CVB3的特異性條帶。2.正常心肌細胞存在survivin低表達，感染CVB3后，心肌細胞survivin mRNA表達明顯增加，且呈時間依賴性，感染CVB3后12h，實驗組心肌細胞survivin mRNA表達較對照組明顯增加，為表達最高峰（2.83±0.36）vs（1.03±0.21）(n=6)（P＜0.05），隨后survivin mRNA表達逐漸減少，于60 h時至最低點，甚至低于正常組（0.41±

7、0.18）vs（1.04±0.11）(n=6)（P＜0.05）。感染CVB3后，心肌細胞survivin蛋白表達明顯增加，且呈時間依賴性，感染CVB3后12h，實驗組心肌細胞survivin蛋白表達較對照組明顯增加，為表達最高峰（1.88±0.39）vs（1.08±0.07）(n=6)（P＜0.05），隨后survivin蛋白表達逐漸減少，60 h時至最低點，甚至低于正常組（0.47±0.41）vs（1.16±0.09）(n=6)（P＜

8、0.05）。
　　3.對照組心肌細胞不同時間點均未見凋亡發(fā)生及cleaved-caspase-3表達，而感染CVB3病毒后實驗組心肌細胞開始出現(xiàn)少量凋亡及cleaved-caspase-3表達，并且隨著感染時間延長，心肌細胞凋亡率及cleaved-caspase-3表達呈逐漸上升趨勢，凋亡率于感染60h達最高值（35.85％±3.76％）vs（0.25％±0.17％）(P＜0.05)，cleaved-caspase-3表達量也于感

9、染60h至高峰(3.46±0.23)vs(1.08±0.12)(P＜0.05)。
　　4.心肌細胞survivin基因表達量與細胞凋亡率存在顯著負相關(r=0.718，P＜0.01);心肌細胞survivin蛋白表達量與細胞凋亡率亦存在顯著負相關（r=0.727，P＜0.01）。
　　5.空病毒與腺病毒載體轉染后，細胞活力和形態(tài)均未受到影響，腺病毒本身對原代培養(yǎng)的正常心肌細胞無明顯細胞毒性及影響。構建的腺病毒能夠從mRNA和

10、蛋白水平有效改變原代培養(yǎng)的心肌細胞survivin的表達(mRNA水平:過表達病毒轉染后，相對于對照組:1.03±0.32;空病毒組1.12±0.19，P＞0.05;腺病毒組:8.17±2.950，P＜0.05;蛋白水平:過表達病毒轉染后，相對于對照組:1.06±0.22;空病毒組0.94±0.13，P＞0.05;過表達病毒組:10.43±3.42，P＜0.05）。6.細胞轉染過表達survivin腺病毒后，鏡下可見細胞損傷較感染對照組

11、明顯減小，心肌細胞病變積分較感染對照組明顯下降（感染對照組:2.79±0.64;空病毒:2.83±0.49;腺病毒:2.07±0.31，P＜0.05）;細胞凋亡率明顯下調（感染對照組:39.67％±9.55％;空病毒:34.84％±6.14％，P＞0.05;腺病毒:25.43％±8.65％，P＜0.05）;cleavedcaspase-3表達明顯下調（感染對照組:1.05±0.12;空病毒:1.09±0.28，P＞0.05;腺病毒:0.