盤基網柄菌突變細胞亞顯微結構及gp150蛋白原核表達與純化研究.pdf

1、盤基網柄菌（Dictyosteliumdiscoideum）是一種低等的單細胞真核原生生物，隸屬原生動物門網柱超綱．營養(yǎng)豐富的條件下，以單細胞形式存在，在饑餓狀態(tài)下，細胞開始發(fā)生聚集，野生型細胞株KAx-3經過細胞聚集階段，細胞丘，蛞蝓體和子實體階段，最終形成由柄細胞和孢子細胞組成的子實體。由于其發(fā)育周期短，生命現象豐富，發(fā)育程序受到精密的調控，成為了研究細胞分化，細胞發(fā)育，細胞信號傳導、形態(tài)發(fā)生等的良好模式生物。
　　 gpl

2、50是盤基網柄菌細胞丘時期表達的異嗜性粘附分子，是細胞發(fā)育的一種必需分子，在蛋白分類上屬于跨膜蛋白，由LagC基因編碼，一個97kD糖蛋白。gpl50缺失的細胞株AK127缺乏該蛋白，發(fā)育被阻滯在細胞疏松聚集階段，不能完成最終發(fā)育，可見gpl50蛋白在盤基網柄菌發(fā)育過程中起著重要作用，它可能參與介導細胞分化和凋亡的信號轉導途徑，但具體的信號通路至今仍未完全清楚。因此本研究一方面通過形態(tài)學研究觀察gpl50缺失的細胞株AK127的超微結構

3、，一方面用分子生物學的手段對gpl50蛋白進行原核表達，為深入探究其結構和功能關系提供理論基礎。
　　 野生型細胞發(fā)育14h后，細胞處于發(fā)育關鍵點，而處在相同發(fā)育時間段的AK127突變細胞的亞顯微結構特征未見有報道，為搞清發(fā)育期間AK127細胞亞顯微結構特征，本研究用透射電鏡觀察了發(fā)育14h、16h、20h的細胞，結果發(fā)現：發(fā)育14h細胞內含豐富內質網系統(tǒng)，由內質網組織圍裹細胞質密度明顯低于周圍的細胞質，能清楚地觀察到多層膜組成

4、的多膜結構。據此我們推測多膜結構最早起源于內質網系統(tǒng)。發(fā)育到16h時，多膜結構內某些膜開始解體，形成自噬泡。自此我們對自噬泡的起源也有了一個較明確的認識。發(fā)育20h細胞內有一個內含數個多膜結構的大自噬泡。據此我們推測多膜結構作為一個儲備營養(yǎng)成分“倉庫”，為維持細胞生命所用。自噬泡僅僅消化多膜的同心圓結構，并不損傷其他細胞器，幫助細胞度過饑餓環(huán)境，其功能與野生型細胞中的自噬泡明顯不同。研究中還發(fā)現細胞核的內核膜產生凹陷，使內外核膜間產生一

5、個含絲狀物質的泡狀空間，內核膜上可見螺旋狀染色物質，外核膜表面布滿顆粒狀物質。這種局部空泡化的細胞核附近出現一些外被一圈顆粒狀物質，內有低電子密度絲狀物的小泡，而只有出現局部空泡化細胞核周圍才出現上述小泡，因此我們推測這些小泡的出現很有可能是外核膜上布滿顆粒狀物質分泌到細胞質中導致的結果。我們觀察到在發(fā)育的各階段，線粒體數目豐富且嵴完整，既沒有發(fā)生內自噬現象，也沒有發(fā)生嵴瓦解現象。這與野生型的線粒體內自噬現象形成了對比，說明了線粒體結構

6、變化與細胞分化有一定關系，突變細胞沒有發(fā)生明顯的細胞分化。這些數據為進一步分析gpl50分子在細胞生長和發(fā)育過程中的作用提供了新的資料。
　　 深入研究gp150蛋白結構與功能，無疑會對我們理解細胞粘著及粘附分子在多細胞發(fā)育進程中的作用有重要意義。而探究蛋白質高級結構的前提是獲得大量高純度的蛋白，所以，本實驗利用基因工程的方法，將gp150全蛋白在大腸桿菌里進行了可溶性表達，SDS-PAGE電泳結果顯示，含Actin15啟動子的

7、載體可以在大腸桿菌宿主菌BL21中啟動目的基因的表達，目的條帶的量約占全菌蛋白的15％左右。本實驗接著采用離子交換法對gpl50蛋白的純化方法進行了初步探索。選取了CM、DEAE、Q三種離子交換樹脂分別在三個PH梯度吸附條件下進行試驗，由于蛋白表達量未達到理想程度，本實驗室已保存的表達載體Actinl5-LagC不含融合表達標簽，離子交換樹脂吸附的雜蛋白較多，蛋白分離純化效果不理想。由于摸索最佳純化條件還需要較長時間，離子交換法純化蛋白

8、的工作具有較大困難，所以后續(xù)工作用PCR方法從本實驗室已保存的表達載體Actinl5-LagC上擴增LagC基因，將其克隆至pET32a原核表達載體，重新構建了重組載體pET32a-LagC，構建的重組質粒帶有6個組氨酸標簽，經測序鑒定讀碼框完整準確，沒有突變，成功地構建了gpl50蛋白的原核表達載體，為進一步的蛋白融合表達，純化和高級結構研究打下了基礎，也為研究gpl50蛋白在盤基網柄菌細胞發(fā)育中的作用提供必要前提和有力工具。本研究首

9、次運用了生物信息學的方法對gp150蛋白進行了分析，采用Gamier-Robson和Chou-Fasman兩種方法進行gpl50蛋白二級結構預測，并應用Kyte-Doolittle的親水方案、Emini的蛋白質表面可能性方案、Karplus-Sohulz的柔性蛋白預測方案和Jameson-Wolf的抗原指數方案進行綜合分析，預測結果表明該蛋白形成a螺旋結構的能力較弱，a螺旋存在于第348-353,598-602，685-688，731～