拮抗放線菌W7的篩選、鑒定及次生代謝產(chǎn)物的研究.pdf

1、放線菌是具有巨大實(shí)用價(jià)值的一類(lèi)微生物,利用其產(chǎn)生抗生素制備的新型農(nóng)藥,具有無(wú)污染、無(wú)殘留、可再生等特點(diǎn),有效地避免了化學(xué)農(nóng)藥帶來(lái)的諸多環(huán)境問(wèn)題,是未來(lái)開(kāi)發(fā)農(nóng)藥的方向。但就其數(shù)量、質(zhì)量和品種而言,仍然不能滿(mǎn)足生產(chǎn)發(fā)展的需求,因此尋找新型菌種已成為放線菌領(lǐng)域的研究重點(diǎn)。青海生態(tài)條件復(fù)雜而獨(dú)特,決定了放線菌資源的獨(dú)特性,為分離篩選新型菌種提供了可能。本研究從青海高原枸杞根際土壤中進(jìn)行拮抗放線菌的分離、純化,最終獲得一株對(duì)多種細(xì)菌具有抑菌活性的

2、放線菌,對(duì)其進(jìn)行鑒定,并對(duì)其發(fā)酵條件、活性物質(zhì)進(jìn)行初步研究,主要研究結(jié)果如下:
　　1.共獲得90株形態(tài)、顏色各異的菌株,采用瓊脂塊法與杯碟法相結(jié)合進(jìn)行初篩和復(fù)篩,最終獲得一株抑菌活性較好的菌株,將其命名為W7。該菌株對(duì)短小芽孢桿菌、產(chǎn)氣桿菌、金黃色葡萄球菌、地衣芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、蠟狀芽孢桿菌、綠膿桿菌均具有抑菌活性,其中對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌活性最強(qiáng),抑菌圈直徑達(dá)到20mm以上,對(duì)真菌效果不明顯。以青霉素為標(biāo)準(zhǔn)品,通過(guò)二劑

3、量法測(cè)得該菌株發(fā)酵液的效價(jià)為2.452u/ml。
　　2.通過(guò)點(diǎn)滴法與葉片夾毒法發(fā)現(xiàn)菌株W7發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)試蟲(chóng)具有較好的觸殺活性和胃毒活性,且觸殺活性好于胃毒活性。
　　3.綜合形態(tài)學(xué)特征、生理生化特征及16SrDNA序列分析對(duì)放線菌W7進(jìn)行分類(lèi)鑒定,將其初步鑒定為Streptomyces aurantiacus的一個(gè)變種。
　　4.通過(guò)單因素和正交試驗(yàn)相結(jié)合對(duì)菌株 W7的發(fā)酵培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化,結(jié)果表明最優(yōu)發(fā)酵工藝條件為:

4、初始pH為8,裝液量為75ml/300ml,發(fā)酵溫度為28℃,接種量為4ml,轉(zhuǎn)速為140-180r/min,發(fā)酵時(shí)間為168h。最優(yōu)培養(yǎng)基為玉米粉2％,酵母粉0.6%,磷酸氫二鉀0.075%,氯化鈉0.025%,硫酸鎂0.05%,硫酸亞鐵0.002%。
　　5.對(duì)菌株W7發(fā)酵液中活性物質(zhì)的穩(wěn)定性進(jìn)行了研究。經(jīng)121℃高壓處理20min后,發(fā)酵液的抑菌圈直徑為16.8mm,經(jīng)紫外照射6h后,發(fā)酵液的抑菌圈直徑仍然達(dá)到17mm,在p

5、H4~10的酸堿處理下,發(fā)酵液的抑菌活性無(wú)明顯下降,但pH為2時(shí),抑菌圈大小為15.7mm, pH為14時(shí)抑菌圈直徑為12.6mm,經(jīng)8周時(shí)間的室溫保存,發(fā)酵液的活性沒(méi)有出現(xiàn)明顯下降。以上結(jié)果說(shuō)明發(fā)酵液具有良好的酸堿、紫外照射、儲(chǔ)藏及熱穩(wěn)定性,但在強(qiáng)酸強(qiáng)堿條件下不穩(wěn)定。
　　6.采用有機(jī)溶劑對(duì)發(fā)酵液萃取發(fā)現(xiàn),活性物質(zhì)可以被正丁醇、乙酸乙酯、氯仿萃取,且極性越強(qiáng),有機(jī)相分配率越高,而石油醚、苯不能,該物質(zhì)可能是一種中高度極性抗生素;