中國青島文昌魚死亡受體及接頭分子的進化與功能研究.pdf

1、本論文通過分子克隆手段得到中國青島文昌魚的3個死亡受體基因(分別命名為91614，91616和91618)。序列分析顯示，文昌魚3個死亡受體胞外識別配體的區(qū)域和TRAIL受體OPG(TNFR家族成員之一)的同源性最高，我們預測這3個死亡受體可能是TRAIL識別受體的祖先分子。系統(tǒng)進化分析推測文昌魚死亡受體的產生源于一次TNFR胞外區(qū)與FADD死亡結構域的重組事件。成體原位雜交實驗證明文昌魚3個死亡受體主要在消化道、肝盲囊、性腺和皮膚等免

2、疫相關的組織進行表達，在LPS刺激后表達有小幅上調，印證了這類凋亡相關的受體分子可能參與文昌魚的免疫反應。轉錄本研究表明91616和91618具有多種剪接體，亞細胞定位實驗表明文昌魚死亡受體能夠準確定位于HEK293T和Hela細胞的細胞膜上，而缺失了信號肽或者胞內死亡結構域的剪接體則不能進行準確的定位。進一步的功能研究表明過表達文昌魚的死亡受體能夠依賴其胞內的死亡結構域引發(fā)Hela細胞發(fā)生凋亡，但該類基因的過表達并不激活NF—κB、A

3、P-1等核轉錄因子，這說明在文昌魚中出現(xiàn)的死亡受體不僅僅具有完整的結構，而且已經能夠發(fā)揮誘導細胞凋亡的功能，同時不同剪接體可能提供了完善的調控機制。 本論文還克隆得到凋亡信號通路中另一個關鍵的接頭分子并命名為BbtCRADD，且對該分子及本實驗室已經得到的BbtFADD1和BbtFADD2分子進行了詳細的細胞定位分析和初步的功能驗證。結果顯示BbtFADD1和BbtCRADD主要在細胞質中形成絲狀結構，而BbtFADD2在細胞核

4、內呈點狀或絲狀分布。和哺乳動物FADD和CRADD的細胞定位進行比較分析，表明文昌魚的這類分子可能已經具備了寡聚化后誘導細胞凋亡的活性，提示我們經由FADD和CRADD募集caspase誘導凋亡的信號通路在文昌魚中已經形成。然而，意外的是我們發(fā)現(xiàn)這三個分子在Hela細胞和293T細胞中過表達均不能誘導細胞凋亡，相反，BbtFADD1能有效地激活NF—κB這條抗凋亡的信號通路。這提示我們雖然FADD分子保守地在果蠅直到脊椎動物中存在，但在

5、不同的進化階段，它們所發(fā)揮的功能不盡相同。而文昌魚三個死亡受體是否可以募集這類分子進行下游的信號傳遞還有待進一步的研究。 總的來說，本論文的發(fā)現(xiàn)重新定義了TRAIL受體的出現(xiàn)始于文昌魚，其首次出現(xiàn)即經歷了倍增。不僅如此，這類原始的基因還存在著復雜的多剪接體形式，這表明該類基因在脊椎動物祖先中已經出現(xiàn)并具備了可調節(jié)的、誘導凋亡的功能。多剪接體的形式暗示了其功能的復雜性和新穎性，同時多接頭分子的存在和功能的分化也表明一個初具雛形的死