miRNA-21在伊馬替尼敏感型胃腸間質瘤中的表達及通過B淋巴細胞瘤-2基位點作用機制研究.pdf

1、目的：
　　本文預通過研究miRNA-21在胃腸道間質細胞瘤樣本的表達情況，探索miRNA-21的表達與伊馬替尼敏感性胃腸道間質細胞瘤臨床病理特征的相關性，為尋找伊馬替尼敏感性胃腸道間質細胞瘤治療新的藥物靶點提供有效的基礎實驗研究，我們又進一步研究的miRNA-21與Bcl-2在胃腸道間質細胞瘤的相互關系及作用機制，為進一步研究miRNA-21在胃腸道間質細胞瘤中的作用基因靶點提供新的實驗證據，其研究成果可以直接應用到胃腸道間質細

2、胞瘤藥物開發(fā)和臨床治療，無論是對于提高胃腸道間質細胞瘤的治療效果，降低其患者醫(yī)療花費和社會家庭的負擔均具有重大意義。為其相關miRNA-21與Bcl-2靶點的抗癌藥物的開發(fā)在臨床應用的進一步推廣提供科學依據。
　　方法：
　　1.胃腸道間質瘤組織樣本獲取，胃腸道間質瘤T1細胞培養(yǎng)
　　于Cosmo Bio Co.Ltd(Tokyo，Japan)公司購買胃腸道間質瘤T1細胞，細胞用DMEM配方其主要組成為細胞溶液中添加1

3、0％的胎牛血清，1％ v/v的青霉素和1％ v/v的鏈霉素(Ameresco，Framingham，MA，USA)，將細胞種植在培養(yǎng)瓶中，在5％ CO2、37℃的加濕培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。將濃度為85％的胃腸道間質瘤T1細胞在加有2％小牛血清和5uM的伊馬替尼(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO，USA)的DMEM培養(yǎng)液中共培養(yǎng)，培養(yǎng)的細胞作為伊馬替尼藥物干擾細胞組。我們利用Lipofectamine RNAiMax(Inv

4、itrogen，Carlsbad，CA，USA)試劑盒轉染生成含有非特異靶標miRNA和含有miRNA-21的85％胃腸道間質瘤細胞，并在DMEM培養(yǎng)液中共培養(yǎng)。
　　2.RNA的提取與定量測量
　　利用TRIzol試劑盒(Life Technologies，Grand Island，NY，USA)從胃腸道間質瘤細胞，正常胃組織作為照組組標本中提取總mRNA，并滴加核糖核酸酶抑制劑SUPERase·InTM(Thermo S

5、cientific，Rockford，IL，USA)1μl，通過RT-qPCR對目標基因進行擴增，42℃，5 min，接著95℃，10秒鐘逆轉錄，95℃，5秒，60℃，20秒，共40個循環(huán)。用Takara One Step RT-PCT kit(Takara，Tokyo，Japan)試劑盒定量分析Bcl-2 mRNA和miRNA-21的含量。
　　3.熒光素酶印跡實驗
　　我們用熒光素酶把載體插入三個相同的miRNA-21的

6、靶位點Bcl-2基因3'UTR位點，利用脂質體2000將Bcl-2位點和Bcl-2mut位點轉染到濃度為85％胃腸道間質瘤細胞，同時將30和60 nM miRNA-21和對照小RNA進行轉染，轉染共培養(yǎng)24小時后利用雙熒光素試劑盒(Promega，Madison，WI，USA)進行檢測實驗。
　　4.細胞增殖實驗、MTT比色法和細胞凋亡實驗
　　胃腸道間質瘤T1細胞種植在12孔細胞培養(yǎng)板，每個孔有300個細胞，12小時后培養(yǎng)

7、板分為兩組，第一組加入0μM伊馬替尼，第二組加入5μM伊馬替尼，并且將60 nM非特異靶標miRNA和miRNA-21對細胞進行轉染，轉染后將細胞培養(yǎng)于37攝氏度5％CO2箱中96個小時，(0.005％)結晶紫染色胃腸道間質瘤細胞30分鐘，記錄克隆數量。
　　用MTT比色法主要檢測處理后的胃腸道間質瘤細胞活力，其過程簡單描述如下，將胃腸道間質瘤細胞種植于96孔培養(yǎng)板上，12小時后培養(yǎng)板分為兩組，第一組加入0μM伊馬替尼，第二組加入

8、5μM伊馬替尼，并且將60 nM非特異靶標miRNA和miRNA-21對細胞進行轉染，轉染后將細胞培養(yǎng)于37攝氏度5％CO2箱中48個小時，細胞培養(yǎng)液換成MTT溶液在37攝氏度培養(yǎng)2小時，在分光光度計上在450nm的光波下測量其光密度。
　　細胞活性主要測量胃腸道間質瘤細胞和對照組細胞活性相對比值，用AnnexinⅤ-FITC Apoptosis Detection Kit(Abcam，Cambridge，UK)試劑盒對胃腸道間質

9、瘤細胞進行染色，通過流式細胞儀檢測胃腸道間質瘤細胞在伊馬替尼處理miRNA轉染后細胞凋亡水平。
　　結果：
　　1.胃腸道間質瘤中miRNA-21和Bcl-2 mRNA的含量及兩者的相關性分析
　　我們分析比較了全部31例胃腸道間質瘤病例特征（表1示），在胃腸道間質瘤細胞內，定量測量了miRNA-21和Bcl-2表達，其中miRNA-21/U6相對量為0.6729±0.07632，其含量顯著低于正常胃組織細胞的含量(1

10、.0000±0.1085)差異具有統(tǒng)計學意義(p=0.0129)，而Bcl-2 mRNA水平在胃腸道間質瘤組中（1.500±0.1484）顯著性高于正常胃組織細胞的含量（1.0000±0.1085）(p=0.0103)，差異具有統(tǒng)計學意義。接著比較了miRNA-21和Bcl-2 mRNA之間的相關性，我們發(fā)現miRNA-21和Bcl-2 mRNA呈顯著性負相關關系，(R2=0.2450，p=0.0046)，總之，在胃腸道間質瘤細胞中，m

11、iRNA-21水平下調，Bcl-2上調，兩者呈顯著性負相關。
　　2.在胃腸道間質瘤中miRNA-21的作用位點Bcl-2的3'端非編碼區(qū)與Bcl-2上調的機制的關系
　　通過對胃腸道間質瘤-T1細胞轉染miRNA-21 mimics，然后測量Bcl-2的表達。表2顯示，與轉染miRNA相比，轉染miRNA-21 mimics后的胃腸道間質瘤-T1細胞miRNA-21水平顯著上調，而與miRNA-21相反，Bcl-2 mRN

12、A的水平在轉染miRNA-21 mimics后的胃腸道間質瘤-T1細胞顯著性下調，(p＜0.05 or p＜0.01 for the30 or60 nM，).
　　為了證實否是由于miRNA-21作用于Bcl-2的3'非編碼區(qū)，而使Bcl-2的下調，我們在轉染miRNA-21 mimics和轉染對照miRNA的胃腸間質瘤細胞進行比較，采用了熒光素酶活性檢測來研究Bcl-2的3'非編碼區(qū)質粒報告和單純Bcl-2的3'非編碼區(qū)報告，熒

13、光素酶報告顯示，與對照組轉染RNA的胃腸間質瘤細胞比較，轉染30和60 nMmiRNA-21 mimics的胃腸間質瘤細胞熒光素酶活性顯著降低(p＜0.001 for30 or60nM)，而Bcl-2mut報告miRNA-21 mimics并無降低熒光素酶，以上研究證實了在胃腸間質瘤細胞中，miRNA-21作用于Bcl-2的3'非編碼區(qū)，而使Bcl-2的下調。
　　3.miRNA-21可以使胃腸道間質瘤細胞對伊馬替尼敏感
　

14、　采用克隆實驗進一步驗證胃腸道間質瘤細胞中miRNA-21是否能使細胞對伊馬替尼治療敏感，5μM伊馬替尼顯著降低胃腸道間質瘤細胞克隆(p＜0.01)，同樣，與對照組轉染miR的胃腸道間質瘤細胞比較，5μM伊馬替尼顯著降低轉染60 nM miR-21 mimics胃腸道間質瘤細胞克隆(p＜0.001，p＜0.05).，
　　同時，我們檢測了轉染60 nM miR-21 mimics和miR Control對照的并用伊馬替尼處理的胃腸

15、道間質瘤細胞的活性和細胞凋亡率，miRNA-21可使胃腸道間質瘤細胞對伊馬替尼藥物的敏感性增強。
　　結論：
　　1、我們成功的培養(yǎng)了胃腸道間質瘤細胞T1的模型，為進一步研究胃腸道間質瘤細胞的特性奠定了基礎。
　　2、miRNA-21在胃腸道間質瘤細胞內表達較正常胃粘膜細胞降低，而Bcl-2mRNA和Bcl-2蛋白在胃腸道間質瘤細胞內比正常胃粘膜細胞增高，miRNA-21和Bcl-2 mRNA呈顯著性負相關關系。

16、>　　3、轉染miRNA-21 mimics后的胃腸道間質瘤-T1細胞miRNA-21水平顯著上調，而Bcl-2 mRNA的水平在轉染miRNA-21 mimics后的胃腸道間質瘤-T1細胞顯著性下調，在蛋白水平也證實了Bcl-2蛋白在轉染miRNA-21 mimics后的胃腸道間質瘤-T1細胞顯著性下調。
　　4、在胃腸間質瘤細胞中，miRNA-21作用于Bcl-2的3'非編碼區(qū)，而使Bcl-2的下調。
　　5、伊馬替尼顯

17、著降低胃腸道間質瘤細胞克隆。
　　6、伊馬替尼顯著降低轉染miR-21 mimics胃腸道間質瘤細胞克隆。
　　7、轉染miR-21 mimics和miR Control對照的并用胃腸道間質瘤細胞細胞活性無差異，而轉染miR-21 mimics和miR Control對照的并用伊馬替尼處理可以使胃腸道間質瘤細胞細胞活性顯著性降低。
　　因此本文通過研究miRNA-21在胃腸道間質細胞瘤樣本的表達情況，探索miRNA-2

18、1的表達與伊馬替尼敏感性胃腸道間質細胞瘤臨床病理特征的相關性，為尋找伊馬替尼敏感性胃腸道間質細胞瘤治療新的藥物靶點提供有效的基礎實驗研究，同時我們發(fā)現miRNA-21與Bcl-2在胃腸道間質瘤中的表現顯著性負相關，miRNA-21通過作用于Bcl-2的3'非編碼區(qū)使其下調，并且miRNA-21可提高胃腸道間質瘤細胞對伊馬替尼的敏感性。本研究其研究成果可以直接應用到胃腸道間質細胞瘤藥物開發(fā)和臨床治療，無論是對于提高胃腸道間質細胞瘤的治療效