孤獨癥相關基因NRXN3β啟動子區(qū)域的研究.pdf

1、目的:確定 NRXN3β基因中具有啟動子活性功能的區(qū)域,并限定最小的啟動子區(qū)域范圍,尋找具有調控NRXN3β基因啟動子轉錄的順式作用元件所在區(qū)域,證實順式元件中對啟動子活性起主要作用的核心堿基。
　　方法:分別構建涵蓋Genbank數(shù)據(jù)庫里NRXN3β基因的轉錄起始位點上游約1500bp、下游約300bp的NRXN3β基因啟動子正向序列和反向序列-熒光素酶報告基因載體。將人胚腎細胞HEK293用實驗室常規(guī)方法培養(yǎng)后，使用自Invi

2、trogen公司購得的轉染試劑Lipofectamine2000，將構建的兩個 NRXN3β基因啟動子-熒光素酶報告基因載體轉染48孔板培養(yǎng)的 HEK293并使其在該細胞內表達出熒光素酶。轉染后的細胞進行裂解，細胞裂解液中的熒光素酶活性使用 Promega公司購得的雙熒光素酶檢測試劑（E1910）進行測定，在同批次轉染的內參pGL4.10載體的熒光素酶活性校準后，用最終活性的比值反應 NRXN3β基因的啟動子活性，確定NRXN3β基因序

3、列NRXN3β-1445/+302E具有啟動子活性。然后在該段序列基礎上進行5’端刪切和3’端刪切并構建相應的啟動子-熒光素酶報告載體比較熒光素酶活性的差異，發(fā)現(xiàn)了 NRXN3β基因中具有啟動子活性兩個最小區(qū)域 NRXN3β-543/-121E和NRXN3β-50/+117E，并確定對啟動子活性起調控作用的順式作用元件所存在的序列NRXN3β-110/-80。最后分別以p4NRXN3β-543/+117E、p4NRXN3β-100/+1

4、17E和 p4NRXN3β-110/+117E為模版，使用基因定點突變技術在序列 NRXN3β-110/-80中進行堿基突變并比較熒光素酶活性，確定了對啟動子活性有重要作用的順式作用元件中的核心堿基。
　　結果：成功構建了涵蓋不同區(qū)域序列的NRXN3β基因啟動子-熒光素酶報告載體，最長插入序列片段長1747bp，包含NRXN3β基因的轉錄起始位點上游1445bp到下游302bp的序列。繼續(xù)刪切NRXN3β-1445/+302E的5

5、’端及3’端并轉染HEK293，發(fā)現(xiàn)序列中存在一系列影響啟動子活性的激活區(qū)域及抑制區(qū)域,同時分析發(fā)現(xiàn)序列NRXN3β-543/-121E及NRXN3β-50/+117E這兩個序列中均可能含有啟動子最小活性區(qū)域。在啟動子 NRXN3β-50/+117E的5’端刪切發(fā)現(xiàn)-110/-80區(qū)域可能包含調控啟動子轉錄的順式作用元件，并對NRXN3β的啟動子活性可能起關鍵作用。通過對序列-110/-90的堿基進行基因定點突變發(fā)現(xiàn)，位于-107/-1

6、05、-101/-99、-98/-95的堿基是順式作用元件中的核心堿基。對比數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)-110/-80序列是一段高GC含量區(qū)域，存在多個候選轉錄因子的結合位點。
　　結論：通過實驗我們成功找到了包含 NRXN3β基因啟動子的兩個最小區(qū)域NRXN3β-543/-121E和NRXN3β-50/+117E，并確定對啟動子活性起主要作用的序列NRXN3β-110/-80，該序列中存在調控啟動子活性的順式作用元件，確定了順式作用元件中的核心