SCF復合體SCFFBXO21在抗病毒天然免疫中的功能及其機制研究.pdf

1、天然免疫系統(tǒng)是人體抵抗外來病原微生物感染的第一道防線，在病毒感染過程中，模式識別受體通過識別病毒中的病原相關分子模式啟動抗病毒天然免疫反應及程序性的細胞死亡從而限制、抵抗病毒的感染。泛素化修飾是機體關鍵的蛋白質翻譯后修飾方式之一，它發(fā)生在細胞活動的各個階段，在免疫應答過程中也發(fā)揮著非常重要的作用，作為泛素化修飾過程中的關鍵分子，E3泛素連接酶在抗病毒天然免疫反應過程中的新功能、新調控方式的研究一直是免疫學研究的熱點問題。因此，本實驗室對

2、病原微生物刺激后的小鼠原代腹腔巨噬細胞及單核巨噬細胞細胞系RAW264.7細胞進行了E3泛素連接酶表達譜芯片的分析，從該芯片結果中，我們關注到了一群以往在天然免疫中功能鮮有報道的E3泛素連接酶家族SCF復合體(SKP1-CUL1-F-BOX protein complex)，該復合體的標志性蛋白為發(fā)揮底物蛋白識別功能的F-BOX蛋白，我們分析了芯片結果中F-BOX蛋白的表達量及反應性并選擇了8個功能未知的FBXO蛋白篩選了它們在抗病毒天

3、然免疫中的功能，從中確定了SCFFBXO21作為我們進一步研究的對象。
　　在本研究中我們發(fā)現(xiàn)了FBXO21在抗病毒天然免疫及病毒誘導的細胞死亡中發(fā)揮著重要的作用。在小鼠原代巨噬細胞及RAW264.7細胞中，干擾FBXO21可以明顯抑制VSV病毒及HSV病毒所刺激的IL-6，IFN-β的產生。利用免疫共沉淀、質譜分析技術以及Western blot實驗發(fā)現(xiàn)了FBXO21可以與ASK1相互結合并且對其進行K29多聚泛素化修飾。ASK

4、1是TLR信號及凋亡信號中的關鍵調控分子，但是它在抗病毒天然免疫中的功能以及修飾方式還不明確。因此我們對ASK1在抗病毒天然免疫中的修飾和功能做了深入分析。
　　利用CRISPER/CAS9基因編輯系統(tǒng)構建FBXO21表達缺陷的RAW264.7細胞后，用VSV、HSV刺激細胞，F(xiàn)BXO21-/-RAW264.7細胞中ASK1的K29多聚泛素化水平明顯低于對照組，下游的JNK、P38、TBK1、IRF3的磷酸化水平以及IL-6、IF

5、N-β的表達也明顯的降低，但病毒在其中的復制卻明顯的增強。另一方面，在VSV、HSV刺激細胞后，F(xiàn)BXO21表達缺陷的細胞的死亡也明顯的弱于對照組。利用ASK1激酶活性缺失以及泛素化位點突變的載體進行實驗后發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)BXO21對ASK1進行的泛素化修飾可以促進其激酶活性從而活化下游抗病毒及細胞死亡信號。信號通路抑制劑的研究發(fā)現(xiàn)JNK1/2是FBXO21-ASK1下游活化的關鍵信號通路。通過以上的研究，我們得出了以下結論:FBXO21可以通