雪旺細胞及神經(jīng)干細胞復合Chitosan-PLGA細胞相容性研究.pdf

1、第一章：雪旺細胞誘導神經(jīng)干細胞分化的體外共培養(yǎng)實驗研究
　　目的：本實驗旨在探索一種快速簡便的獲取大量高純度雪旺細胞（Schwann Cells，SCs）的方法，并從神經(jīng)干細胞（Neural Stem Cells，NSCs）與SCs共培養(yǎng)為出發(fā)點，探究共培養(yǎng)后SCs及對NSCs分化方向的影響以及分化后神經(jīng)元細胞形態(tài)學表現(xiàn)。
　　方法：采用治療濃度為0.25％的中性酶（Dispase）與質(zhì)量濃度為0.2%膠原酶（NB4）復合酶

2、消化法，消化3-5d齡的大鼠坐骨神經(jīng)，獲取原代 SCs，0.25%中性酶純化傳代，S100細胞免疫熒光染色鑒定 SCs純度；誘導分化實驗分為三組：SCs組，NSCs組，SCs-NSCs共培養(yǎng)組，分別種植于分化培養(yǎng)基條件下，并于共培養(yǎng)第七天，采用特異性標記物GFAP、Map2免疫熒光染色標記鑒定分化后的細胞(GFAP鑒定星形膠質(zhì)細胞，Map2鑒定神經(jīng)元細胞)。
　　結(jié)果：通過復合膠原酶與中性酶的方法，可快速獲得高純度SCs；體外共培

3、養(yǎng)分化培養(yǎng)基條件下，共培養(yǎng)組有更多的神經(jīng)元細胞，而NSCs組則更傾向于向星形膠質(zhì)細胞分化，SCs組在分化培養(yǎng)基條件下，細胞無分化傾向，細胞性質(zhì)不變，S100特異性標記物染色陽性。
　　結(jié)論：復合酶消化法可以獲取高純度SCs；SCs與NSCs共培養(yǎng)可促進NSCs向神經(jīng)元的分化。
　　第二章：內(nèi)置納米纖維細絲的靜電紡絲Chitosan-PLGA神經(jīng)導管的制備
　　目的：本研究擬采用二維管狀帶芯編織技術(shù)和熱定型等工藝制作具有

4、一定彈性和機械強度的導管，以更好地滿足橋接周圍神經(jīng)缺損的要求。
　　方法：本研究中，采用帶芯編織生物材料神經(jīng)導管，管狀神經(jīng)導管的內(nèi)徑確定，即等于金屬芯棒的外徑；生物材料神經(jīng)導管編織物的表面均勻，不太容易變形。本研究中，選用殼聚糖初生纖維溶解在稀酸溶液中配成質(zhì)量濃度為3.5%殼聚糖漿液的方法，對生物材料神經(jīng)導管進行涂層和熱定型處理，以使其具有良好的保形性和優(yōu)良的力學性能，進一步提高其使用性能。我們在本研究中，還在Chitosan-P

5、LGA導管內(nèi)放置了縱行排列的納米纖維細絲以使導管具有三維立體結(jié)構(gòu)。這些納米纖維不僅僅起到了支撐神經(jīng)導管的管狀結(jié)構(gòu)的作用，也模擬了再生神經(jīng)的體內(nèi)生長內(nèi)環(huán)境。普通光學顯微鏡及掃描電子顯微鏡檢查，以觀察靜電紡絲 Chitosan-PLGA神經(jīng)導管及其內(nèi)置納米纖維細絲的物理形態(tài)及 SCs、NSCs在導管上的生長的形態(tài)學表現(xiàn)。
　　結(jié)果：靜電紡絲Chitosan-PLGA神經(jīng)導管，導管內(nèi)徑確定，不易變形，內(nèi)置的納米纖維細絲對導管起到支撐作用

6、，具有良好的保形性和優(yōu)良的力學性能；SCs與NSCs可以與這種神經(jīng)導管良好的黏附。
　　結(jié)論：內(nèi)置納米纖維細絲的靜電紡絲Chitosan-PLGA神經(jīng)導管模擬神經(jīng)生長三維立體結(jié)構(gòu)，是一種理想的橋接修復外周神經(jīng)損傷的生物材料。
　　第三章：雪旺細胞及神經(jīng)干細胞與Chitosan-PLGA神經(jīng)導管的細胞相容性研究
　　目的:研究雪旺細胞、神經(jīng)干細胞與內(nèi)置縱行排列納米纖維絲的靜電紡絲的細胞相容性，及兩種細胞在靜電紡絲Chit

7、osan-PLGA導管材料上的黏附及定向生長情況。
　　方法:實驗總共分為三組：SCs組，NSCs組SCs-NSCs共培養(yǎng)組，三組細胞分別與Chitosan-PLGA納米導管材料復合培養(yǎng)于分化培養(yǎng)基。四甲基偶氮唑藍（MTT）比色法觀察各組細胞在1、3、5、7d存活率情況；倒置相差顯微鏡下觀察各組細胞與靜電紡絲 Chitosan-PLGA神經(jīng)導管內(nèi)置的納米纖維細絲的黏附生長情況以及掃描電鏡下觀察共培養(yǎng)組細胞在Chitosan-PLG

8、A上的生長情況及細胞形態(tài)學表現(xiàn)。
　　結(jié)果：共培養(yǎng)細胞組細胞存活率明顯高于SCs組，SCs組又高于NSCs組；倒置相差顯微鏡下，各組細胞均可與導管內(nèi)置的納米纖維細絲很好的黏附生長，且共培養(yǎng)組細胞黏附的更為緊密，細胞數(shù)目也更密集；電子掃描顯微鏡下，SCs及NSCs能很好的沿Chitosan-PLGA內(nèi)置納米纖維絲上生長并呈現(xiàn)定向生長的趨勢。
　　結(jié)論：雪旺細胞及神經(jīng)干細胞共培養(yǎng)可促進細胞與Chitosan-PLGA材料的相容性