長苞凹舌蘭提取物對運動訓練大鼠機體影響的組織表達譜研究.pdf

1、在運動醫(yī)學研究領域，運動疲勞的發(fā)生與轉歸機理、消除運動疲勞提高機體運動能力的新方法篩選、運動能力的遺傳學研究、人類是否存在運動疲勞相關基因群等問題是目前國際上諸多專家、學者高度關注和最令人振奮的課題。目前，中醫(yī)藥消除運動性疲勞的研究，多以中醫(yī)理論的整體觀念出發(fā)，以臟腑學說為中心，并結合現(xiàn)代醫(yī)學基礎理論，運用較先進的科研手段和方法，使中醫(yī)的辯證論從宏觀走向微觀，中藥的研究從主觀判定向客觀指標發(fā)展。我們應用組織芯片技術研究長苞凹舌蘭提取物對

2、運動訓練大鼠機體的影響，為探討運動疲勞產生的規(guī)律和機制，選擇科學的中藥加速疲勞消除，提高運動能力提供科學的實驗依據。 組織芯片具有體積小、信息含量高、并可根據不同的需要進行組合和設計的特點。它適用于免疫組化操作、原位PCR、原位雜交，并能大大提高實驗效率，而且可根據需要靈活設計，所得結果均一可靠、可比性強，具有高通量、并行性、多樣本、省時快速、簡便經濟、用途廣泛、結果可靠、便于設計實驗對照等優(yōu)點。本實驗首次將組織芯片技術引入運動

3、人體科學研究領域，建立了運動大鼠組織芯片，為組織芯片技術在運動人體科學研究領域的應用進行了探究性研究。 材料與方法：采用健康雄性SD(Sprague-Dawley)大鼠。實驗動物由西安中醫(yī)研究院實驗動物中心提供，飼料采用該實驗動物中心提供的國家標準嚙齒類動物干燥飼料。實驗大鼠均為3月齡，其平均體重為255±20g，共48只。常規(guī)分籠飼養(yǎng)，自由飲水進食，常規(guī)光照，，動物室溫度為18℃～23℃，濕度40～60％。加藥組每日以長苞凹舌

4、蘭提取物灌胃1ml，其余則灌胃安慰劑蒸餾水。按實驗要求將大鼠分為安靜對照組，有氧訓練組，大強度疲勞組，服藥對照組，服藥有氧組，服藥大強度組各8只。 長苞凹舌蘭藥材購自陜西中藥材市場，經陜西師范大學生命科學院植物教研室任毅教授鑒定為蘭科植物長苞凹舌蘭的G.conopsedR.Br.的塊莖。長苞凹舌蘭藥材300g加入95％乙醇放入超聲發(fā)生儀提取3次，過濾，合并濾液，回收乙醇，入旋轉蒸發(fā)儀蒸發(fā)呈糊狀，至不再有酒精蒸出，以蒸餾水溶出備用

5、，溶液濃度1％。 運動方案：(1)對照組及加藥對照組：正?；\內生活狀態(tài)，自由飲食，不運動。(2)有氧訓練組及加藥有氧組：每周5d，共8week。適應性訓練3d后開始增加運動時間和運動速度：第1d，訓練10min，速度10m/min，第2d訓練15min，速度10m/min，第3d訓練時間為15min，速度13m/min，如此，運動時間、速度隔日交替增加：先增時間，遞增時間5min，遞增速度3m/min。運動速度增至20m/min

6、，運動持續(xù)時間增至60min后持續(xù)該強度和運動量。 (3)疲勞訓練組及加藥疲勞組：每周6d，共8week。適應性訓練3d后開始增加運動時間和運動速度：第1d速度10m/min，時間10min第2d速度10m/min，時間15min，第3d速度13m/min，時間15min。運動強度增加同上，當運動速度增至20m/min，增加跑臺坡度為5度，最終運動速度增至35m/min，運動持續(xù)時間增至60min。 大鼠運動訓練8wee

7、k于末次訓練后次日上午摘取眼球取血。待檢血紅蛋白、血睪酮和皮質醇的血樣加入0.1％肝素抗凝，待檢其他指標者離心取血清。灌注固定取材，摘取各組織、固定，制作組織芯片。 采用免疫組織化學SABC法觀察各組織Bax、Bcl-2、Cx43、Cx45、Hsp-27、c-fos指標積分光密度的變化。 結果：1.不同運動訓練強度可抑制大鼠體重的增長率，尤其疲勞訓練表現(xiàn)明顯；中藥長苞凹舌蘭提取物對體重的增長沒有明顯影響；有氧和疲勞訓練對

8、提高心臟重量、心系數有著明顯的意義，中藥長苞凹舌蘭提取物對心系數無顯著影響。 2.中藥長苞凹舌蘭提取物在一定程度上可以降低Bun濃度、升高血紅蛋白、血糖和血睪酮濃度，延緩疲勞的發(fā)生；中藥長苞凹舌蘭提取物可在一定程度上改善運動性低T癥，提高大鼠運動能力；同時它升高LDH、降低CK在血液中的濃度。 3.成功制備組織芯片。得到包含144組織點6套組織蠟塊，蠟塊完整，肉眼可見組織點排列整齊，無缺損現(xiàn)象。組織點直徑1mm，相距1m

9、m，切片厚度3μm。芯片各點陣排列整齊，薄厚均勻，HE染色層次分明，對比明顯，缺片率在0～2％之間，組織折疊現(xiàn)象少見；經形態(tài)學觀察顯示與大組織切片在形態(tài)學上無差異；與預設計符合率達95～100％。 4.建立大鼠了長苞凹舌蘭提取物對運動訓練大鼠機體影響的組織表達譜。5.Bax蛋白在心肌、肝組織和骨骼肌中表達最多，胃腸和血管平滑肌中表達較少；Bax蛋白表達量在服藥大鼠組織中，與對照組比較，具有顯著差異。 6.Bcl-2蛋白在

10、肝組織、心肌表達較多，在胃腸平滑肌、血管平滑肌及骨骼肌中表達較少；在某些組織中服藥組表達顯著性減少，而在另外一些組織中則相反，提示藥物對蛋白表達產生影響。 7.中等強度運動訓練增高骨骼肌和肝組織中Bcl-2/Bax值，提示中等強度運動訓練比安靜狀態(tài)時大鼠骨骼肌和肝組織細胞更不易發(fā)生凋亡，中等強度運動訓練對骨骼肌和肝組織具有保護作用；大強度運動時，Bcl-2在骨骼肌中的表達顯著降低，Bcl-2/Bax值大強度組小于服藥大強度疲勞組

11、，提示中藥長苞凹舌蘭提取物在大強度運動中對骨骼肌有保護作用；中等強度運動強度對大鼠的心肌Bcl-2/Bax比值無顯著性影響；中藥長苞凹舌蘭提取物對大鼠的心肌Bcl-2/Bax基本無影響；中藥長苞凹舌蘭提取物可以有效地降低血管平滑肌Bcl-2/Bax比值，具有保護血管平滑肌作用。 8.c-fos蛋白在肝組織及心肌和骨骼肌中表達較多，在其他組織中表達較少；服藥組大鼠肝組織內c-fos蛋白表達量大幅度下降，提示中藥長苞凹舌蘭提取物有保

12、護肝組織的作用；而在骨骼肌和血管平滑肌中服藥組較未服藥組表達上升；服藥組大鼠的心肌c-fos表達量與未服藥組沒有明顯區(qū)別，提示中藥長苞凹舌蘭提取物對大鼠心肌影響不大。 9.中藥長苞凹舌蘭提取物對Hsp-27蛋白在有氧訓練組和大強度疲勞組表達的影響大于安靜對照組，服藥有氧組和有氧訓練組相比，除了肝組織和血管平滑肌外，其他組織的Hsp27蛋白表達均較有氧訓練組有較大幅度的下降，其中胃腸平滑肌、骨骼肌和心肌中Hsp27蛋白表達與有氧訓

13、練組有顯著下降；在服藥大強度組也有類似表現(xiàn)。這說明中藥長苞凹舌蘭提取物對骨骼肌、心肌和肝組織有一定程度的保護作用。 10.Cx43在神經系統(tǒng)中都有表達，其中在脊髓表達最為豐富，其次為海馬CAⅠ區(qū)、皮質和小腦。隨著運動強度的增加，脊髓和皮質中的Cx43表達兩變化不明顯，海馬CAⅠ區(qū)和CAⅢ區(qū)Cx43表達呈下降趨勢，而在小腦中Cx43的表達則表現(xiàn)出上升的趨勢；隨著運動強度增加Cx43在心肌中的表達增加；而藥物干預對其亦有顯著的影響，