苜蓿中華根瘤菌刀豆氨酸外運系統(tǒng)SsiR-SsiAB調控機制的研究及其對共生結瘤的影響.pdf

1、苜蓿中華根瘤菌可以與牧草植物苜蓿和草木樨共生結瘤。本文選擇本實驗室分離的苜蓿中華根瘤菌Sinorhizobium medicae1128為研究對象，用質粒pJZ260上的mariner轉座子隨機插入苜蓿中華根瘤菌以建立突變文庫，用無啟動子的卡那霉素抗性基因（KmR）為報告基因，以其宿主植物紫花苜蓿種子浸提物為誘導物，從中篩選到能夠誘導其卡那霉素抗性基因表達的4株突變株（命名為smA，SmB，smC和smD.），經過ArbitrayPCR

2、擴增、DNA測序以及BLAST分析后確定轉座子插入的基因與LysE家族外運蛋白、組氨酸氨解酶、咪唑酮丙酸酶、NADH：黃素氧化酶基因同源。
　　 同時通過轉錄融合報告基因lacZ的方法證實ssiA以及其下游基因ssiB都能被種子浸提物及刀豆氨酸誘導，但誘導能力不同，ssiA-lacZ比ssiB-lacZ的誘導能力強。通過不同的氨基酸誘導asiA-lacZ和ssiB-lacZ發(fā)現(xiàn)，ssiA-1acZ和ssiB-lacZ都能被刀豆氨

3、酸誘導，而其他的常見堿性氨基酸不能誘導其表達，通過比對發(fā)現(xiàn)，ssiA基因與中慢生型天山根瘤菌的刀豆氨酸外運基因msiA具有75％的同源性，可能為刀豆氨酸外運有關的基因，而ssiB卻與之沒有同源性。而后通過基因敲除和互補表達asiA上游ssiR的方法證明，和LysR類轉錄調節(jié)蛋白同源的SsiR蛋白可能是asiA和ssiB基因的轉錄調節(jié)蛋白，此蛋白也與中慢生型天山根瘤菌的msiA的調節(jié)蛋白MsiR有75％的同源性。
　　 在體外無酵

4、母粉含量的情況下，刀豆氨酸對ssiA和ssiB單獨缺失和同時缺失的突變株的毒性要比野生型高，同時發(fā)現(xiàn)ssiA缺失突變株比ssiB缺失突變株對刀豆氨酸更敏感，ssiAB對不同的濃度的刀豆氨酸敏感程度也不同，這說明雖然可能ssiA和ssiB表達的蛋白可能都為刀豆氨酸外運蛋白，但外運能力不同。
　　 根毛吸附實驗和共生結瘤實驗發(fā)現(xiàn)，ssiA，ssiB和同時缺失都能導致吸附能力的降低，這是由于突變株對苜蓿分泌的大量的刀豆氨酸敏感造成的。

5、隨后的共生結瘤實驗發(fā)現(xiàn)前期ssiA和ssiAB的突變株都能造成結瘤數的下降和結瘤率的下降，但45天后差異更小或沒有差異，很可能是隨著植株的生長，分泌的刀豆氨酸減少造成的。
　　 根據上述試驗數據提出苜蓿根瘤菌Sinorhizobiun medicae1128的SsiR/SsiAB系統(tǒng)和其宿主苜蓿種子浸提物中刀豆氨酸的互作模型：在苜蓿生長初期，種子和植株分泌大量的殺菌物質刀豆氨酸刀豆氨酸可能殺死植株周圍潛在的有害細菌，而對苜蓿生長