孫絡絀急-疏失-瘀阻-滋生的微血管病變中醫(yī)微觀病理特征研究.pdf

1、目的：本文通過對孫絡絀急、疏失、瘀阻、滋生相對應的微血管痙攣、缺血、栓塞、新生的大鼠腸系膜微血管模型的微觀可視化研究，探尋四種孫絡病變的中醫(yī)微觀病理特征;并通過腸組織缺血再灌注損傷模型及腸組織血管新生模型，研究內(nèi)皮細胞、內(nèi)皮屏障、肥大細胞、炎癥反應在腸組織缺血再灌注損傷中的作用機制;同時研究通絡中藥通心絡對孫絡病變及腸組織病變的干預作用。
　　方法：孫絡四個病變模型制作：(1)采用腸系膜表面局部滴加去甲腎上腺素的方法制作大鼠腸系膜

2、微血管痙攣模型;(2)采用腸系膜上動靜脈缺血30分鐘再灌注60分鐘的方法制作大鼠腸系膜微血管缺血模型;(3)采用大鼠尾靜脈注射光敏劑血卟啉單甲醚后立即激光照射腸系膜微血管的方法制作微血管栓塞模型;(4)采用腸系膜上動靜脈缺血30分鐘后恢復再灌注7天的方法制作大鼠腸系膜微血管新生模型。腸組織損傷兩個模型制作：(1)采用夾閉腸系膜上動靜脈30min后恢復再灌60min方法制作腸組織缺血模型，并于再灌注60min時取材檢測;(2)采用夾閉腸系

3、膜上動靜脈30min后恢復再灌3d、7d方法制作腸組織血管新生模型，并于再灌注3d和7d分別取材檢測。四種孫絡病變研究及腸組織缺血研究的分組設計相同，均為50只大鼠隨機均分為五組，即空白組、模型組、通心絡低劑量組、通心絡中劑量組、通心絡高劑量組。腸組織血管新生研究應用100只大鼠隨機均分為五組，即空白組、實驗組、通心絡低劑量組、通心絡中劑量組、通心絡高劑量組。通心絡低、中、高劑量組分別應用400、800、1600mg/kg/d的通心絡超

4、微粉灌胃給藥，空白組和模型組予等量生理鹽水灌胃，孫絡絀急、疏失、瘀阻研究及腸組織缺血研究的大鼠在造模前連續(xù)灌胃7天，孫絡滋生研究造模后連續(xù)灌胃7天，腸組織血管新生研究大鼠于造模后連續(xù)灌胃3或7天。孫絡病變檢測方法：應用正立共聚焦顯微鏡觀察并測量腸系膜微血管的變化情況，孫絡絀急、疏失、瘀阻、滋生研究均于造模前記錄大鼠腸系膜微血管基礎狀態(tài)，孫絡絀急、疏失、瘀阻實驗于造模后立即記錄微血管的病理變化，孫絡滋生實驗于造模后第7天記錄微血管新生的病

5、理變化。檢測指標：(1)孫絡絀急比較造模前后絀急時間、微血管管徑、血流速度及肥大細胞脫顆粒情況的變化;(2)孫絡疏失比較造模前后微血管血流狀態(tài)、側枝數(shù)目、側枝長度和出血情況的變化;(3)孫絡瘀阻記錄微動脈內(nèi)出現(xiàn)血小板黏附及血栓阻塞微動脈的時間、停止照射后微動脈血流再通情況，以及照射后5min、10min、15min、20min和停止照射后5min、10min、15min時的血栓面積;(4)孫絡滋生比較造模前與造模7天后微血管管徑及側枝數(shù)

6、量、長度的變化。應用Image-Pro Plus6.0軟件測量并計算相關數(shù)據(jù)。腸組織損傷檢測方法：究，采用CD31+TUNEL免疫熒光雙染方法測定腸組織微血管內(nèi)皮細胞凋亡情況，通過免疫組化方法測定VE-Cadherin、ANGPTL4、HMGB1和NF-κB在腸組織中的表達情況;(2)腸組織血管新生研究采用c-Fos+Trytase免疫熒光雙染方法測定腸組織肥大細胞活化情況，通過免疫組化方法測定PECAM-1、NF-κB p65、TNF

7、-α、VE-Cadherin在腸組織中的表達情況，通過RT-PCR方法測定腸組織中TLR4、ANGPTL-1、miR126基因表達的情況。
　　結果：孫絡病變實驗結果：急研究顯示造模后微動脈迅速收縮、痙攣，表現(xiàn)為微血管管徑逐漸縮窄至管腔閉塞、微血管內(nèi)血流停止，隨后逐漸恢復正常，同時伴有明顯的肥大細胞脫顆?，F(xiàn)象，空白組未發(fā)生微血管收縮、痙攣的改變;通心絡預給藥減少了微動脈痙攣的時間、抑制微動脈管徑縮小、縮短了痙攣過程、同時抑制痙攣引

8、起的肥大細胞脫顆粒反應，結果與模型組比較均差異明顯(P＜0.05)。(2)孫絡疏失研究顯示空白組微血管無顯著異常改變，而模型組微血管側枝數(shù)量減少、側枝長度減少，并出現(xiàn)出血情況，伴有微血管內(nèi)血流速度減慢，結果與空白組比較均差異明顯(P＜0.05);通心絡預給藥顯著抑制微血管側枝數(shù)量、長度的減少以及出血趨勢，同時促進微血管內(nèi)血液正常流動，結果與模型組比較差異明顯(P＜0.05)。(3)孫絡瘀阻研究顯示空白組微動脈無顯著異常改變，模型組微動脈

9、內(nèi)出現(xiàn)血小板滾動、黏附，并逐漸形成血栓阻塞微動脈，停止照射后血栓并未消散，血小板黏附時間、血栓阻塞微動脈時間、停照后血流恢復情況及各時間點血栓面積的結果與空白組比較均差異明顯(P＜0.05);通心絡預給藥組顯著延長血小板黏附和血栓阻塞微動脈的時間，減少血栓面積，并促進栓塞后微動脈血流的再通，結果與模型組比較差異明顯(P＜0.05);(4)孫絡滋生研究顯示空白組微血管正常生長，包括主干的增粗和側枝的生長，模型組Ⅰ/R區(qū)和非Ⅰ/R區(qū)的微血管

10、較空白組管徑異常增粗、側枝數(shù)量及長度異常減少(P＜0.05)，通心絡治療可以顯著抑制造模后微血管管徑異常增粗、促進側枝數(shù)量及長度正常生長(P＜0.05)。腸組織損傷實驗結果：(1)腸組織缺血研究顯示，模型組內(nèi)皮細胞凋亡指數(shù)顯著高于空白組(P＜0.05)，通心絡低、中、高劑量組的內(nèi)皮細胞凋亡指數(shù)均顯著低于模型組(P＜0.05)，且通心絡高劑量組與空白組比較內(nèi)皮細胞凋亡指數(shù)無明顯差別(P＞0.05);模型組VE-Cadherin及ANGPT

11、L4的表達較空白組僅稍有增高或不增高，通心絡低、中、高劑量組較模型組比較可以顯著促進VE-Cadherin及ANGPTL4蛋白的表達(P＜0.05);模型組HMGB1和NF-κB的表達較空白組明顯增高(P＜0.05)，通心絡低、中、高劑量組較模型組比較可以顯著抑制HMGB1和NF-κB蛋白的表達(P＜0.05)。(2)腸組織血管新生研究顯示，Ⅱ/R后3天和7天，模型組炎癥反應相關的肥大細胞活化水平、TLR4mRNA、TNF-α、NF-κ

12、B的表達量均顯著升高(P＜0.05)，且TLR4mRNA、TNF-α、NF-1B在Ⅱ/R后7天較Ⅱ/R后3天表達進一步升高(P＜0.05);模型組黏附分子PECAM-1表達升高(P＜0.05)，緊密連接蛋白VE-cadherin表達降低(P＜0.05)，VE-cadherin在Ⅱ/R后7天較Ⅱ/R后3天表達進一步降低(P＜0.05);模型組ANGPTL4表達降低(P＜0.05)，miR126表達升高(P＜0.05)。通心絡低、中、高劑量

13、組可以顯著降低Ⅱ/R后3天和7天炎癥相關肥大細胞活化水平、TLR4mRNA、TNF-α及NF-κB的表達量、降低黏附分子PECAM-1的表達、升高緊密連接蛋白VE-cadherin和血管保護蛋白ANGPTL4的表達(P＜0.05)。
　　結論：孫絡病變研究結論：(1)孫絡絀急以孫絡持續(xù)收縮、攣急為特征，伴有孫絡運行氣血功能的缺失;(2)孫絡疏失以孫絡數(shù)目的減少、孫絡運行氣血功能喪失為特征，伴有氣血溢出孫絡外的表現(xiàn);(3)孫絡瘀阻以

14、孫絡內(nèi)氣血瘀滯逐漸形成壞血、死血阻塞孫絡為特征，伴有孫絡功能的缺失;(4)孫絡滋生以孫絡主干異常增粗、側枝異常減少為特征，伴有無序無功能孫絡的異常增多。通心絡預給藥或治療可以一定程度的緩解或抑制孫絡病變的病理過程、促進孫絡損傷的恢復。腸組織損傷研究結論：(1)腸組織缺血存在內(nèi)皮細胞凋亡、內(nèi)皮屏障損傷和嚴重炎癥反應的病理變化，通心絡預給藥可以減輕內(nèi)皮細胞凋亡、保護內(nèi)皮屏障并減輕炎癥反應。(2)腸組織血管新生存在以肥大細胞活化、TLR4-N