肝臟型脂肪酸結合蛋白介導脂肪酸通過內質網應激凋亡途徑引起人近端小管上皮細胞凋亡.pdf

1、目的:蛋白尿是慢性腎臟疾病(Chronic kidney disease，CKD)的共同表現，大量蛋白尿可引起腎小管及間質的損傷和炎癥。而與白蛋白(albumin，Alb)結合的游離脂肪酸(free fat acids，FFAs)通過脂毒性，引起細胞功能障礙和損傷，參與了腎間質損傷的過程。已有研究表明飽和脂肪酸棕櫚酸(Palmitic acids，PA)可誘導非脂肪細胞的損傷和凋亡。
　　脂毒性包含了多種應激反應，如內質網應激和氧

2、化應激等。內質網應激通過未折疊蛋白反應(unfolded protein response，UPR)維持細胞內環(huán)境的穩(wěn)態(tài)。但持久強烈的ERS會通過內質網相關性死亡途徑(ER-associateddeath)，引起細胞凋亡。
　　肝臟型脂肪酸結合蛋白(liver-type fatty acid binding protein，L-FABP/FABP1)是脂肪酸結合蛋白家族一員，人腎近曲小管上皮細胞表達。尿L-FABP被認為與腎小管間

3、質損傷密切相關，是監(jiān)測CKD進展的標志物之一。
　　本課題前期研究表明，油酸(Oleic acids，OA)誘導L-FABP表達和ERS，并導致HK-2細胞凋亡。為了進一步探討L-FABP與ERS之間的關系，本研究比較沉默HK-2細胞L-FABP前后，高PA和OA干預下的HK-2細胞，ERS相關蛋白和凋亡相關蛋白的表達變化，試圖明確L-FABP在FFA通過ERS誘導細胞凋亡中的作用，為臨床FFAs引起腎小管細胞凋亡提供實驗依據。<

4、br>　　方法:1、實驗分組:
　　(1)HK-2細胞隨機分為Control，高棕櫚酸(PA)，高油酸(OA)和高蛋白(Alb)干預組。
　　(2)HK-2細胞分別轉染shNC或shL-FABP后，分別給予高PA、OA和Alb干預，并設立對照組shNC、和shL-FABP。具體實驗分組如下。
　　2、MTT法確定HK-2細胞50％生存率的PA濃度;
　　3、Western blot法確定PA、OA干預HK-2細胞

5、時間;
　　4、觀察PA、OA和Alb干預對L-FABP、HK-2細胞內質網應激相關蛋白及凋亡蛋白表達的影響;
　　5、觀察轉染shL-FABP質粒后，PA、OA和Alb干預對HK-2細胞中的L-FABP、內質網應激相關蛋白及凋亡蛋白表達的影響。
　　結果:
　　1、確定PA對HK-2細胞的干預濃度
　　不同濃度PA干預HK-2細胞24h，發(fā)現PA濃度為200μmol/L HK-2細胞生存率為40％，接近5

6、0％。故選取PA濃度200μmol/L為干預濃度。
　　2、PA干預HK-2細胞L-FABP的表達變化
　　PA分別干預HK-2細胞3h，6h，12h，24h和48h的結果顯示:與干預前比較，3h，6h和12h L-FABP蛋白表達無明顯變化，24h表達達到峰值，48h表達減少。
　　3、OA干預HK-2細胞L-FABP的表達變化
　　OA分別干預HK-2細胞3h，6h，12h，24h和48h的結果顯示:與干預前

7、比較，12h，24h和48h L-FABP蛋白表達增加，但24h達到峰值。
　　4、PA、OA和Alb干預對HK-2細胞L-FABP蛋白表達的影響
　　OA組和PA組L-FABP表達均高于正常對照組，Alb組與Control組無明顯區(qū)別。
　　5、PA、OA和Alb干預對HK-2細胞內質網應激相關蛋白及凋亡蛋白表達的影響
　　OA組和PA組內質網應激相關蛋白和凋亡相關GRP78、CHOP、Caspase3和Cle

8、ave Caspase3的表達均高于Control組;Alb組與Control組無明顯區(qū)別。
　　6、shL-FABP質粒下調HK-2細胞中的L-FABP蛋白表達水平。
　　熒光結果顯示，shNC組和shL-FABP組均可捕獲質粒所攜帶的綠色熒光。
　　與Control組相比，shL-FABP組HK-2細胞的L-FABP蛋白的表達水平明顯降低。
　　7、shL-FABP質粒下調PA和OA誘導的HK-2細胞內質網應

9、激相關蛋白的高表達。
　　(1) PA+shNC組與shNC組相比較， GRP78、PERK和p-PERK蛋白的表達水平明顯增高。敲低L-FABP后，PA+shL-FABP組與PA+shNC組相比較，GRP78、PERK、p-PERK蛋白的表達水平明顯降低。
　　(2) OA+shNC組與shNC組相比較，GRP78、PERK和p-PERK蛋白的表達水平明顯增高。敲低L-FABP后，OA+shL-FABP組與OA+shNC組

10、相比較， GRP78、PERK、p-PERK蛋白的表達水平明顯降低。
　　(3) Alb+shNC組與shNC組相比較，PERK蛋白的表達水平有所增高，GRP78和p-PERK蛋白的表達水平無明顯變化。敲低L-FABP后，Alb+shL-FABP組與Alb+shNC組相比較，PERK和p-PERK蛋白的表達水平有所下降，GRP78蛋白的表達水平無明顯變化。
　　8、shL-FABP質粒下調PA和OA誘導HK-2細胞內質網相關

11、凋亡蛋白的高表達。
　　(1) PA+shNC組與shNC組相比較，CHOP、Caspase3和CleaveCaspase3蛋白的表達水平明顯增高。敲低L-FABP后，PA+shL-FABP組與PA+shNC組相比較，CHOP、Caspase3和Cleave Caspase3蛋白的表達水平明顯下調。
　　(2) OA+shNC組與shNC組相比較，CHOP、Caspase3和CleaveCaspase3蛋白的表達水平明顯增高

12、。敲低L-FABP后，OA+shL-FABP組與OA+shNC組相比較，CHOP、Caspase3和Cleave Caspase3蛋白的表達水平明顯下調。
　　(3) Alb+shNC組與shNC組相比較CHOP、Caspase3和CleaveCaspase3蛋白的表達水平無明顯增高。敲低L-FABP后，Alb+shL-FABP組與Alb+shNC組相比較，CHOP、Caspase3蛋白的表達水平無明顯下調，Cleave Casp

13、ase3蛋白表達水平有所下調。
　　結論:
　　1、PA和OA上調HK-2細胞L-FABP蛋白，ERS相關蛋白以及ER相關凋亡蛋白表達，這一結果證實OA和PA可誘導L-FABP蛋白表達，ERS和ER相關的凋亡的發(fā)生。
　　2、沉默HK-2細胞的L-FABP，PA和OA干預上調的ERS相關蛋白以及ER相關凋亡蛋白有意義降低，證實L-FABP參與了FFAs誘導的ERS，并最終激活細胞ERS相關凋亡的發(fā)生。
　　3、高