人CD4+T淋巴細胞活化相關的miRNA的篩選和功能鑒定.pdf

1、微小RNA（microRNA，miRNA）是一類長度約為22nt、內源性的小分子非編碼RNA，通過和靶mRNA的3'末端非翻譯區(qū)(3'untranslational region，3'UTR)完全互補或部分互補結合，使mRNA降解或抑制其翻譯。研究發(fā)現(xiàn)，miRNA在線蟲、果蠅、植物、哺乳動物、甚至病毒中廣泛存在，在各個物種間具有高度的進化保守性。miRNA在表達上具有組織和時間的特異性，是調節(jié)其他功能基因表達的重要調節(jié)分子，在生物體的各

2、種生命活動過程中發(fā)揮著重要作用，參與生命過程中一系列重要進程，包括發(fā)育進程、造血過程、器官形成、凋亡、細胞增殖和腫瘤的發(fā)生。
　　適應性免疫是免疫系統(tǒng)在進化過程中形成的針對特定抗原物質的高度專一性的防御機制,包括以T細胞為主的細胞免疫和以B細胞為主的體液免疫。在這個復雜的系統(tǒng)中miRNA發(fā)揮著巨大的作用。盡管有研究探索了naiveCD8+T細胞，效應性CD8+T細胞和記憶性CD8+T細胞中miRNA的表達變化，但是在T細胞的活化過

3、程中差異表達的miRNA的真正的作用仍然不清楚。所以進一步深入研究這些miRNA在T細胞活化和分化過程中的生物學功能有助于我們更好的調控適應性免疫應答。
　　本課題用ExiqonmiRNA基因表達譜芯片檢測了用CD3抗體和CD28抗體雙信號活化Jurkat細胞前后差異表達的miRNA，發(fā)現(xiàn)了5種miRNA在Jurkat細胞活化后表達下調。實時定量檢測驗證了芯片的結果。由于在已有的報道中發(fā)現(xiàn)，miR-181家族的成員miR-181a

4、與T細胞和B細胞的發(fā)育有著密切的關系，在體外實驗中也已證實anti-CD3抗體誘導的T淋巴細胞的活化會使miR-181的表達受到抑制。所以我們選擇了miR-181c作為后續(xù)實驗的miRNA分子。
　　為了進一步確實miR-181c和人CD4+T淋巴細胞活化的關系，我們用磁珠分離出正常健康人血中的CD4+T淋巴細胞，實時定量證實在活化的人CD4+T淋巴細胞中miR-181c的表達也是下調的。這與ExiqonmiRNA基因表達譜芯片及

5、Jurkat細胞檢測結果一致。
　　通過在網站http://microrna.sanger.ac.uk/和http://www.targetscan.org/上預測，發(fā)現(xiàn)T細胞活化通路的相關分子IL-2，CD69，IL1A，MAP3K3，MAP3K10，NFAT5的3'UTR有miR-181c的結合位點，可能為miR-181c作用的靶分子。其中IL-2的3'UTR有2個miR-181c的結合位點，而且在預測的靶分子的評分中排第二位

6、，說明IL-2可能是miR-181c發(fā)揮作用的一個靶點。雙熒光素酶報告系統(tǒng)檢測的結果證實，miR-181c和IL-2的3'UTR有較明顯的結合。后續(xù)實驗中，我們主要驗證miR-181c和IL-2的關系。
　　我們在體外用Jurkat細胞模擬人CD4+T淋巴細胞。將miR-181c轉染到Jurkat細胞內，用anti-CD3抗體和anti-CD28抗體雙信號刺激活化Jurkat細胞，流式細胞術檢測T細胞活化的表面標志分子CD25、C

7、D69和CD154，發(fā)現(xiàn)和對照組相比，miR-181c可以部分抑制Jurkat細胞的活化。
　　將miR-181c和IL-23'UTR及其各種突變體共轉染HEK293細胞，結果顯示miR-181c對含有IL23'UTR全長的熒光素酶報告基因的表達有比較明顯的抑制作用，約為50％，只含有結合位點1的熒光素酶報告基因的表達被抑制了約20％，而只含有結合位點2的熒光素酶報告基因的表達被抑制了約2/3，說明結合位點2的抑制作用更強。

8、>　　為了進一步闡明IL-2是miR-181c的直接靶分子，還是miR-181c通過影響T淋巴細胞的活化間接影響了IL-2的表達水平，我們構建了IL-2的真核表達載體。pcDNA3-IL2CDS-UTR包含IL-2的編碼區(qū)和3'UTR，而pcDNA3-IL2CDS只包含IL-2的編碼區(qū)。將這兩種IL-2真核表達載體轉染HEK293細胞，使得原本不表達IL-2的HEK293細胞上清高表達IL-2。同時轉染合成的miR-181c分子和這兩種

9、IL-2真核表達載體到HEK293細胞中，ELISA檢測HEK293細胞上清中的IL-2，轉染miR-181c和pcDNA3-IL2CDS-UTR組的IL-2水平明顯下調，而同時轉染miR-181c和pcDNA3-IL2CDS組的IL-2水平沒有顯著變化，說明miR-181c可以通過結合IL-23'UTR抑制IL-2蛋白水平的表達。說明IL-2是miR-181c的直接靶分子。
　　將合成的miR-181c分子轉染到人CD4+T淋巴

10、細胞內，用雙信號刺激活化人CD4+T淋巴細胞，流式細胞術檢測T細胞活化的表面標志分子CD25、CD69和CD154，同樣發(fā)現(xiàn)miR-181c可以部分抑制人CD4+T淋巴細胞的活化。
　　轉染miR-181c的人CD4+T淋巴細胞被活化24h后，和對照相比，上清中IL-2的水平明顯下降，說明miR-181c可以抑制人CD4+T淋巴細胞合成分泌IL-2。但是實時定量檢測表明和未活化相比，活化組IL-2mRNA水平顯著上調，而轉染miR

11、-181c并沒有下調IL-2mRNA水平。在Jurkat細胞中觀察到了同樣的現(xiàn)象。說明由于miR-181c與IL-23'UTR相互結合是不完全互補的，所以miR-181c只是抑制了IL-2mRNA的翻譯，而不是降解IL-2mRNA。這與以往的文獻報道相符合。
　　分別給人CD4+T淋巴細胞轉染miR-181c和scramble miRNA（negative control,N.C.），用雙信號刺激活化72h，用MTT檢測其細胞增殖

12、。轉染miR-181c組活化72h后，miR-181c抑制了人CD4+T淋巴細胞的增殖，這可能與轉染miR-181c后IL2的表達水平下調有關。
　　以上實驗結果表明：miR-181c與人CD4+T淋巴細胞的活化有著密切的關系，它可以抑制人CD4+T淋巴細胞的活化，同時也抑制人CD4+T淋巴細胞表達IL-2分子。異位表達IL-2分子的實驗證實可以直接下調IL-2分子的表達，IL-2分子是miR-181c的直接靶分子。miR-181