骨肉瘤患者組織標本間的差異蛋白質組學研究.pdf

1、目的：骨肉瘤是原發(fā)于骨髓的高度惡性腫瘤，是一種間葉組織來源的惡性腫瘤，其特征是增殖的腫瘤細胞直接形成骨或骨樣組織。骨肉瘤好發(fā)于10～20歲的青少年，目前局部發(fā)病未發(fā)生轉移的骨肉瘤患者接受手術治療及新輔助化療后5年生存率可達到60％-70%。然而其病程短且進展快，早期即可出現(xiàn)轉移，最常經(jīng)血行轉移至肺。因大多數(shù)骨肉瘤患者癥狀隱匿，有些患者初診較晚，就診時已經(jīng)出現(xiàn)肺轉移，這類患者即使接受新輔助化療，其對化療藥物會產(chǎn)生很強的耐藥性，其5年生存率

2、只有20-40%左右，預后較差。比較蛋白質組學探索不同時期、不同組織、不同狀態(tài)或不同外界條件作用下細胞或生物體的蛋白質表達變化的相關信息，可以明確重要生理及病理體系差異蛋白質的表達，發(fā)現(xiàn)其異常的原因。其技術的發(fā)展使得高通量篩選不同類型的腫瘤或正常組織的差異蛋白質成為可能，差異表達蛋白質的分析鑒定為腫瘤分子標記物及新藥物治療分子靶點的發(fā)現(xiàn)奠定了基礎，為我們更有利于了解生命活動規(guī)律提供了幫助。本課題比較早期發(fā)生肺轉移的骨肉瘤與早期沒有發(fā)生肺

3、轉移的骨肉瘤間的差異表達蛋白質，在蛋白質水平探查骨肉瘤發(fā)生發(fā)展、耐藥及轉移機制，為骨肉瘤的早期診斷、預后判斷和個性化治療等提供依據(jù)。
　　方法：收集2014年1月至2016年1月河北醫(yī)科大學第三醫(yī)院骨與軟組織腫瘤科確診并通過手術切除的骨肉瘤標本6例，其中分為發(fā)病1年內發(fā)生肺轉移的3例（Ⅰ組）和發(fā)病1年內沒有發(fā)生肺轉移的3例（Ⅱ組），利用TCA-丙酮沉淀法分別對收集的Ⅰ組和Ⅱ組樣品提取總蛋白，各組混合后再由胰酶對各組總蛋白質進行消化

4、為多肽。以不同iTRAQ試劑盒對各組總蛋白消化得到的肽段分別進行標記，將混合肽段用強陽離子交換柱和C18反向柱進行分級分離，采用液質聯(lián)用質譜檢測技術進行鑒定，數(shù)據(jù)結果經(jīng)Mascot檢索軟件在Uniprot_human數(shù)據(jù)庫中進行檢索，得到兩組樣本的總蛋白譜和差異蛋白相對定量定性結果。我們對所得數(shù)據(jù)以閾值（差異倍數(shù)大于1.5，p值小于0.05）進行篩選，對鑒定得的蛋白質進行pathway生物信息分析，得到相應的生物信息通路信息。
　

5、　結果：根據(jù)篩選條件，我們通過Proteome Discoverer1.3軟件共找到兩組間差異表達蛋白202個，KEGG信號通路數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn)了這些差異表達的蛋白質涉及許多癌癥相關的生物信息通路，如：病毒致癌、惡性腫瘤中蛋白聚糖、惡性腫瘤中小分子核糖核酸、癌癥生物路徑等，此外這些差異表達蛋白質還涉及與細胞及蛋白遷移的相關生物信息通路，如：白細胞游出遷移、肌動蛋白細胞骨架的調節(jié)、粘著斑、緊密連接等。其中在這些信號通路中重復率較高的6個相關

6、差異表達蛋白是：α輔肌動蛋白-1、α輔肌動蛋白-4、肌球蛋白調節(jié)輕鏈-9、肌糖蛋白、纖連蛋白和層粘連蛋白α4。其中早期發(fā)生肺轉移骨肉瘤患者標本中表達上調的蛋白有肌糖蛋白、纖連蛋白和層粘連蛋白α4；早期沒有發(fā)生肺轉移的骨肉瘤患者標本中表達上調的蛋白有α輔肌動蛋白-1、α輔肌動蛋白-4和肌球蛋白調節(jié)輕鏈-9。
　　結論：
　　1以早期有無發(fā)生肺轉移的骨肉瘤患者標本作為研究對象，首次采用iTARQ結合LC-MS/MS的方法篩選出了

7、骨肉瘤轉移相關的差異表達蛋白共202個，KEGG信號通路數(shù)據(jù)庫分析顯示了差異蛋白質涉及的信號通路，為研究骨肉瘤的浸潤轉移機制提供了線索。
　　2發(fā)現(xiàn)α輔肌動蛋白1（ACTN1）、α輔肌動蛋白4（ACTN4）、肌球蛋白調節(jié)輕鏈9（MYL9）在早期沒有發(fā)生肺轉移的骨肉瘤患者標本中高表達；而肌糖蛋白（TNC）、纖連蛋白（FN）、層粘連蛋白α4鏈（LAMA4）在早期發(fā)生肺轉移的骨肉瘤患者標本中高表達；說明這幾種蛋白可能與骨肉瘤的侵襲轉移關