IL-1β單克隆抗體在癲癇治療中的價值.pdf

1、研究目的：
　　癲癇是神經(jīng)科常見慢性疾病之一，其病理生理機制復雜。近年來癲癇與神經(jīng)系統(tǒng)炎癥反應及炎性介質的關系已成為研究熱點，受到廣泛關注。
　　最新研究顯示，包括IL-1β在內(nèi)的多種炎性介質在癲癇患者及癲癇動物模型的腦組織中表達水平升高。深入研究發(fā)現(xiàn)IL-1β能提高神經(jīng)元興奮性、增加癇性發(fā)作可能性。本研究通過腹腔注射氯化鋰、匹羅卡品建立癲癇模型，探索能否通過腹腔IL-1β單克隆抗體中和癲癇持續(xù)狀態(tài)所導致IL-1β含量異常升

2、高，觀察白介素1β（IL-1β）單克隆抗體對癲癇持續(xù)狀態(tài)誘導大鼠海馬組織炎癥反應的影響。
　　研究方法：
　　72只健康成年雄性 SD大鼠隨機分為對照組（n=20）、癲癇模型組（模型組，n=26）、IL-1β單抗抗體治療組（治療組，n=26）。模型組和治療組均采用氯化鋰-匹羅卡品建立癲癇模型，對照組以相同液體量的生理鹽水替代氯化鋰、匹羅卡品。當模型組、治療組大鼠癇性發(fā)作達到Racine分級的IV-V級發(fā)作且持續(xù)1小時后，腹腔

3、注射溴化甲基阿托品和地西泮解除癇性發(fā)作。治療組大鼠于癲癇發(fā)作30分鐘、7天及14天后分別給予IL-1β單克隆抗體1ml(20ug? ml)腹腔注射，模型組和對照組則給予等量的生理鹽水。模型組和治療組分別于造模后72h、21d兩個時間點隨機取3只提取海馬組織總蛋白，采用蛋白質印記法檢測用藥后72h、21d海馬組織中 IL-1β單克隆抗體的含量。各組大鼠于造模后72h隨機取10只大鼠斷頭取腦、分離海馬組織和進行腹主動脈抽血，用RT-PCR檢

4、測癇性發(fā)作72h后海馬組織中IL-1β、NF-κB mRNA表達水平，用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）測定血清中S100B含量。各組于造模后21天，大鼠行心臟灌注固定，分離腦組織進行冰凍切片，行免疫熒光法檢測海馬區(qū)膠質細胞活化情況及行尼氏染色檢測神經(jīng)元凋亡情況。通過統(tǒng)計學分析比較IL-1β單克隆抗體對癲癇的干預是否有效。
　　研究結果：
　　1.在注射匹羅卡品10~40min后，模型組大鼠開始出現(xiàn)排便排尿、口角流涎、雙眼充血等

5、外周膽堿能反應；繼之出現(xiàn)面部抽動、行動刻板、平衡力下降、行走不穩(wěn)等表現(xiàn)；最后出現(xiàn)癲癇發(fā)作的典型癥狀：陣發(fā)性出現(xiàn)咀嚼或牙關緊閉、頸項強直或全身肌肉僵硬、濕狗樣抖動、四肢不自主抽搐或痙攣，最終出現(xiàn)全身強直-痙攣發(fā)作并失去平衡、跌倒。模型組造模成功率85.29％，死亡率10.34%（68只大鼠，58只成功建立癲癇模型，其中4只在注射匹羅卡品后24h內(nèi)死亡，2只在癲癇發(fā)作后48h內(nèi)死亡，10只未出現(xiàn)典型的癲癇發(fā)作）。
　　2.模型組大鼠海

6、馬組織中僅檢測到少量 IL-1β抗體，考慮與抗體的交叉反應有關，治療組中給藥72h（3.797±0.021）、21d（3.584±0.024）后大鼠海馬組織中IL-1β單克隆抗體的濃度明顯高于模型組（1.278±0.019、1.351±0.010）。與標準濃度比較發(fā)現(xiàn)不同時間點治療組中 IL-1β單克隆抗體的濃度均>3.00ug Ab/g。結果提示：IL-1β單克隆抗體能夠通過血腦屏障并能保持有效治療濃度（>3.00ug Ab/g）。<

7、br>　　3.模型組IL-1β、NF-κB表達水平均高于對照組（均P<0.01），治療組IL-1β、NF-κB表達水平均低于模型組（均P<0.01）。
　　4.對照組血清中S100B蛋白水平較低，與模型組比較，治療組血清中S100B蛋白水平明顯下降（P<0.01）。
　　5.尼氏染色顯示對照組CA1區(qū)、CA3區(qū)錐體細胞、神經(jīng)元排列整齊，形態(tài)完整；模型組CA1區(qū)、CA3區(qū)有神經(jīng)元脫失及變形、膠質細胞增生（與對照組比較，P<0.

8、05）；與模型組比較，治療組大鼠海馬CA1區(qū)、CA3區(qū)錐體細胞、神經(jīng)元缺失情況顯著減輕（P<0.01）。
　　6.為進一步探討 IL-1β單克隆抗體對于膠質細胞增生的影響，觀察造模后第21天海馬區(qū)膠質細胞增生情況，利用膠質纖維酸性蛋白（GFAP）、Iba1抗體進行熒光雙標。免疫熒光雙標染色顯示，正常對照組大鼠海馬無膠質細胞異常增生，SE21天在海馬CA3區(qū)表現(xiàn)為GFAP與Iba1陽性細胞明顯增多，星形膠質細胞和小膠質細胞增生現(xiàn)象顯

9、著（p<0.05），差異有統(tǒng)計學意義。而治療組GFAP與Iba1陽性細胞較模型組明顯減少（p<0.01）。膠質細胞活化情況顯著減輕（P<0.01）。
　　結論：
　　（1）利用氯化鋰-匹羅卡品建立癲癇模型可誘導大鼠表現(xiàn)為典型的癲癇持續(xù)狀態(tài)，模型大鼠進入慢性期后，通過尼氏染色及免疫熒光染色觀察到海馬CA1、CA3區(qū)出現(xiàn)神經(jīng)元損傷、膠質細胞增生等病理改變，這些病理改變符合人難治性癲癇的典型病理改變，同時氯化鋰-匹羅卡品模型的發(fā)作

10、分期符合人類癲癇的發(fā)病特點。另外該模型實驗周期短、實驗條件成熟、易操作。以上證據(jù)均提示氯化鋰-匹羅卡品癲癇動物模型可以作為研究癲癇發(fā)病機制、治療方法等研究方向的重要選擇之一。
　?。?）IL-1β是最強大的促炎因子之一，其介導的信號轉導途徑是組織炎癥反應的開始。IL-1β作為上游炎性因子能介導多種炎性因子表達上調，繼而誘發(fā)下游的炎癥瀑布反應，NF-κB為細胞內(nèi)重要的下游信號轉導介質之一，參與調節(jié)多種細胞因子的基因轉錄，活化的NF-

11、κB可促進 IL-1β基因轉錄。本實驗中通過RT-PCR檢測實驗動物海馬組織中IL-1β、NF-κB mRNA轉錄水平，實驗結果顯示：模型組IL-1β、NF-κB mRNA表達水平較正常組明顯上調（p<0.05），提示癲癇誘導IL-1β、NF-kB mRNA轉錄、免疫炎性因子介導的炎癥反應在SE中發(fā)揮重要作用。
　?。?）S100B是血腦屏障滲漏和星形膠質細胞損傷的標志物，本實驗證實在癲癇模型大鼠急性期血清中 S100B水平明顯高