CDK11p58自身結構功能及其對甾體類激素受體雄激素受體、維生素D受體調控的研究.pdf

1、第一、二部分CDK11p58對雄激素受體AR、維生素D受體VDR轉錄活性調節(jié)等相關生物學功能機制研究
　　細胞周期素依賴的激酶11(p58)(CDK11p58，p58PITSLRE，p58GTA，p58clk-1)是最早被發(fā)現(xiàn)的CDK11家族蛋白，在β-1，4-半乳糖基轉移酶1分離純化過程中得到，能與β-1，4-半乳糖基轉移酶1相互作用，并磷酸化β-1，4-半乳糖基轉移酶1，對其活性起增強作用。CDK11p58是p34cdc2相關

2、激酶超家族的一員，是一種絲/蘇氨酸蛋白激酶，在細胞內特異性地表達于G2/M期，并且過表達CDK11p58能導致細胞生長緩慢，形態(tài)發(fā)生變化，有絲分裂障礙，使細胞周期阻滯在G2/M期。CDK11p58具有促凋亡作用，且該作用與其激酶活性密切相關。雖然CDK11p58在細胞生長中發(fā)揮著負調控因子的重要作用，但是它的上游調控因子和下游的效應分子還沒有被發(fā)現(xiàn)。
　　雄激素和雄激素受體AR(androgenreceptor)組成的信號通路對于

3、男性個體生殖系統(tǒng)及其它組織器官的發(fā)育、分化，以及男性腫瘤如前列腺癌的發(fā)生、發(fā)展影響密切。作為核受體家族的成員之一，AR在結合了雄激素后，轉位到核內，與靶基因啟動子結合，發(fā)揮轉錄因子的活性。我們研究發(fā)現(xiàn)CDK11p58能夠抑制雄激素受體轉錄活性以及人前列腺癌細胞中的前列腺特異抗原PSA(prostatespecificantigen)的表達及分泌。AR，細胞周期素cyclinD3，CDK11p58三者可以在細胞中形成三元復合物，共定位于前

4、列腺以及睪丸的上皮細胞中。雄激素受體的活性可以被其特殊位點的磷酸化調控，我們研究發(fā)現(xiàn)CDK11p58可以在體內體外磷酸化AR，并明確其磷酸化位點是Ser-308，CDK11p58通過對于AR的磷酸化作用，影響該激素受體的信號通路，從而產(chǎn)生一系列生物學活性，影響AR的轉錄活性以及前列腺癌細胞的生長凋亡變化。
　　維生素D受體VDR(vitaminD3receptor)同雄激素受體AR一樣，也是核受體超家族中的一員，屬于類固醇激素、甲

5、狀腺激素和脂溶性維生素A和D核受體超家族的成員，主要與其他共調節(jié)子一起負責調節(jié)下游靶基因的轉錄，發(fā)揮重要作用。在真核細胞中，VDR通過其配體1，25-(OH)2D3產(chǎn)生生理功能，1，25-(OH)2D3是維生素D的激素形式，主要負責調控體內鈣的動態(tài)平衡。VDR與1，25-(OH)2D3結合導致其構型發(fā)生改變，從而由細胞漿轉位至核內，與RXR形成異源二聚體[14]。該異源二聚體進一步結合靶基因啟動子上的維生素D反應元件VDRE，從而調控其

6、轉錄。
　　以往我們實驗室研究發(fā)現(xiàn)cyclinD3可以調控維生素D受體，影響其表達，而CDK11p58，作為cylinD3的伴侶激酶蛋白，可以調節(jié)AR的活性，那么CDK11p58對于VDR是否也存在一定的調控作用呢，這便是我們進一步的研究重點。我們的研究發(fā)現(xiàn)CDK11p58激酶可以與VDR相互作用，抑制VDR的轉錄調控。進一步研究發(fā)現(xiàn)CDK11p58激酶可以通過促進VDR的泛素化降解降低其蛋白穩(wěn)定性。這些研究結果充分說明CDK11

7、p58激酶對于VDR轉錄因子存在一種負調控作用。這些結果對于更好的理解CDK11p58如何調節(jié)VDR的蛋白水平及轉錄起到重要作用，對于進一步研究其對甾體類激素受體的調控作用奠定了基礎。
　　第三部分CDK11p58自身磷酸化位點Thr-370磷酸化作用與激酶活性及細胞凋亡相關
　　細胞周期依賴激酶11(PITSLRE蛋白激酶)，是細胞周期依賴激酶超家族的一員，主要功能有細胞周期阻滯，促癌變，促凋亡等，而這些功能往往都與其自身

8、激酶活性相關。其中有兩種蛋白，CDK11p110和CDK11p58，它們從相同的轉錄子中轉錄產(chǎn)生，只是CDK11p588起始密碼子AUG不同，造成二者分子量的差異。CDK11p110/CDK11p58激酶在細胞存活和早期胚胎發(fā)育過程中是必需的。
　　CDK11p58包含-保守的p34cdc2相關Ser/Thr蛋白激酶催化結構域，主要位于80-389位氨基酸，同時在結構中還包含N端和C端結構域。CDK11p58盡管也含有與CDK11

9、p110C端相同的激酶活性結構域，但二者功能卻完全不同。CDK11p110蛋白激酶在整個細胞周期中都有穩(wěn)定持續(xù)的表達，主要功能在于調控前RNA剪接和RNA轉錄。相反，分子量較小的CDK11p58卻在細胞周期的G2/M期中特異表達，主要功能是以激酶活性依賴的方式調控細胞周期與細胞凋亡。中華鼠中過表達CDK11p58可以導致晚期分裂延長，異常染色體分離，同時導致細胞凋亡，降低細胞增長率。CDK11p58對于姐妹染色體粘合也是必需的。最新研究

10、還發(fā)現(xiàn)CDK11p58可以促進中心體成熟和紡錘體形成。
　　以往研究表明CDK11p58可以在凋亡信號中發(fā)揮啟動作用，而在糖皮質激素誘導的Fas介導的細胞死亡和凋亡過程中，可以被多種caspases在蛋白末端結構域中發(fā)生剪接。我們實驗室研究發(fā)現(xiàn)CDK11p58可以促進CHX誘導SMMC-7721肝癌細胞的凋亡；CDK11p58在凋亡過程中以激酶活性依賴的方式下調Bcl-2的表達：同時CDK11p58可以cyclinD3相互作用，調

11、節(jié)細胞周期進展；而cyclinD3/CDK11p58復合物通過磷酸化AR參與其負調控，進而抑制雄激素依賴的前列腺癌細胞的增殖；進一步研究發(fā)現(xiàn)CDK11p58也參與調控了雌激素受體ER和VDR甾體類激素受體的負調控，只是具體的調控機制并不相同。
　　盡管CDK11p58在細胞信號傳導過程中發(fā)揮如此重要的作用，但是該蛋白在細胞中功能的基礎，比如蛋白結構以及一些機制問題，我們卻知之甚少。在本研究中，我們首次研究發(fā)現(xiàn)CDK11p58可以發(fā)

12、生自身磷酸化，并且可以自身相互作用，在細胞內形成同源二聚體。但是其激酶活性缺失的點突變D224N，卻無法自身相互作用形成二聚體。然后我們利用點突變技術進一步明確了自身磷酸化位點是Thr-370。進行點突變后，T370A無法自身磷酸化并且喪失激酶活性。更有趣的是，T370A同時也無法抑制AR轉錄活性。同時，該突變體也喪失促進細胞凋亡的功能。這些研究進一步說明Thr-370位點的自身磷酸化與激酶活性和其生物學功能比如細胞凋亡及雄激素受體調控